Kesan Berfaedah Echinacoside Pada Kardiomiopati Diabetik dalam Tikus Db/Db Diabetik

Hubungi: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mel:audrey.hu@wecistanche.com

Xiang Zhang & Yarong Hao

pengenalan

Kardiomiopati diabetik (DCM) ialah komplikasi utama diabetes, dengan morbiditi yang tinggi dan berisiko tinggi untuk penyakit kardiovaskular dan kematian dalam pesakit diabetes.1 Insiden DCM pada pesakit yang mempunyai sejarah diabetes Melebihi atau sama dengan 5 tahun adalah melebihi 44.4 peratus , yang meningkat kepada 56 peratus selepas 8 tahun.2,3 DCM ialah sejenis kardiomiopati primer, yang dimanifestasikan sebagai keabnormalan struktur dan fungsi jantung yang disebabkan oleh apoptosis sel fibrosis miokardium dan lesi mikrovaskular pada pesakit diabetes tanpa penyakit jantung iskemia atau hipertensi dan boleh menyebabkan aritmia jantung dengan kejutan asal jantung dan kematian mengejut dalam kegagalan jantung.4 Disebabkan oleh patogenesis kompleks DCM dan diagnosisnya pada peringkat lanjut, tiada rawatan berkesan wujud.5 Hiperglisemia adalah faktor permulaan semasa patogenesis DCM. Hiperglisemia jangka panjang mengakibatkan metabolisme glukosa dan lipid terganggu dalam kardiomiosit pesakit diabetes, yang membawa kepada kecederaan pada sel endothelial vaskular dan tisu lain, menggalakkan perubahan patologi termasuk hipertrofi, nekrosis, apoptosis, dan fibrosis interstisial miokardium.6,7 Glukosa dan lipid gangguan metabolisme adalah kunci kepada mekanisme patologi DCM. Oleh itu, kawalan berkesan metabolisme tenaga dalam kardiomiosit mewakili strategi terapeutik yang penting untuk DCM.

merawat cistanche tubulosaKardiomiopati diabetes

Pengumpulan lipid miokardium dalam DCM memburukkan lagi perkembangan kegagalan jantung. PPAR- ialah pengawal selia utama pelbagai gen yang berkaitan dalam sistem pengoksidaan asid lemak peroksidase sel, mitokondria, dan mikrosom, dan memainkan peranan penting semasa metabolisme lipid dan pengawalan keradangan dan imuniti.8 PPAR- meningkatkan metabolisme lipid melalui mitokondria dan asid lemak peroksidase beta-pengoksidaan, dimediasi melalui carnitine palmitoyl transferase-I (CPT-I).9 Pengoksidaan asid lemak panjang dan bercabang10 mengurangkan sintesis dan pemasangan lipoprotein dan VLDL.11 Peraturan tidak langsung sintesis asid hempedu menggalakkan perkumuhan kolesterol12 dan menghalang ekspresi gen yang berkaitan dengan keradangan. Ekspresi PPAR dalam hati adalah jauh lebih rendah pada pesakit dengan penyakit hati berlemak bukan alkohol atau dalam model haiwan penggunaan jangka panjang lemak tinggi.13,14 Everett et al menunjukkan bahawa tahap asid lemak bebas yang berkaitan dengan hati meningkat dengan ketara. dalam model tetikus kalah mati PPAR kerana metabolisme lipid yang dilemahkan, menggalakkan steatosis hati.15 Penemuan ini menunjukkan bahawa PPAR- memainkan peranan penting dalam patogenesis metabolisme lipid.

Echinoside (ECH) ialah sebatian semula jadi yang diasingkan daripada batangcistanche tubulosa.Bahan kimia aktif ECH ialah phenylethanoid, yang memaparkan antioksidan, anti-keletihan, anti-tumor, dan kesan anti-radang, dan boleh meningkatkan ingatan, saraf, dan perlindungan hati, dan meningkatkan peraturan imun.16,17 Dalam kajian mengenai db/db tikus diabetik, didapati bahawa ECH boleh meningkatkan ketahanan insulin, meningkatkan tahap HDL, dan mengurangkan tahap TG, TC, dan LDL, menunjukkan bahawa ECH boleh meningkatkan metabolisme lipid diabetik dengan berkesan.18 Selain itu, Shimoda et al membuktikan bahawa echinacoside boleh menjejaskan metabolisme lipid dengan mengawal selia mRNA yang berkaitan dengan pengangkutan sterol hepatobiliari

dan metabolisme.19 Kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa ECH mengawal ekspresi TGF- dan gen hilirannya untuk memperbaiki fibrosis buah pinggang dalam tikus db/db.20 Dalam kajian ini, untuk lebih memahami kesan perlindungan ECH terhadap kecederaan sel miokardium di DCM dan untuk meneroka mekanisme molekulnya yang berpotensi, kami menggunakan tikus db/db sebagai model penyakit DCM dan meneroka mekanisme pengawalseliaan ECH pada protein yang mengawal gangguan metabolisme glukosa dan lipid, tekanan oksidatif dan apoptosis dalam kardiomiosit. Matlamat kami adalah untuk menyediakan asas teori untuk rawatan DCM yang berkesan.

cistanche tubulosa

Bahan dan Kaedah

Bahan Kimia dan Reagen

Serbuk ECH (94 peratus ketulenan dikesan oleh HPLC, Batch No.190906) (Tambahan Rajah 1) diperoleh daripada Shanghai Medical Science Company, Ltd. (Shanghai, China). ECH telah dibubarkan dalam air hingga 2 mg/mL dan disimpan pada 4 darjah dalam gelap. ECH ditadbir pada dos 100–500 mg/kg·d dan diturunkan dengan ketara

glukosa darah dan tahap lipid darah yang bertambah baik.18 ECH memaparkan kesan hipoglisemik dan anti-hiperlipidemik yang bergantung kepada dos.

Haiwan Eksperimen dan Rawatan

Eksperimen haiwan telah dilakukan mengikut garis panduan Institut Kesihatan Kebangsaan (NIH Pub. No 85-23, disemak 1996). Protokol telah diluluskan oleh jawatankuasa etika haiwan eksperimen dan Pusat Pemakanan Haiwan Hospital Renmin Universiti Wuhan (Wuhan, China, No. 20190517). Tikus C57BLKS/J db/db jantan dewasa dan tikus db/m (gred SPF) telah dibeli dari Institut Penyelidikan Bioperubatan Universiti Nanjing–Nanjing (Nanjing, Republik Rakyat China, nombor: SCXK (Sue) 2018-0001). Haiwan dikurung di Pusat Haiwan Hospital Renmin (Wuhan, Republik Rakyat China) pada suhu bilik (20 darjah ), kelembapan relatif 50 peratus -60 peratus dan tertakluk kepada cahaya 12-h/ kitaran gelap. Pemakanan adaptif dilakukan selama 1 jam dan tiada ubat hipoglikemik diberikan.

Selepas kuarantin, tikus db/db secara rawak diberikan kepada kumpulan model diabetes (kumpulan db/db, n{{0}}), kumpulan rawatan ECH (db/db tambah kumpulan ECH, n=11 ) atau kumpulan kawalan db/m (db/m, n=9). Pada 8 minggu, tikus dalam kumpulan db/db dan db/m diberikan oral 0.05 mL/ 10g salin berat badan selama 10 minggu, manakala tikus dalam kumpulan db/db ditambah ECH diberi 300 mg/(kg/d) oral.

ECH mengikut berat badan selama 10 minggu. Berat badan ketiga-tiga kumpulan tikus dipantau setiap minggu, dan pemakanan, minum, dan aktiviti dinilai. Sebaik sahaja tikus berpuasa selama 8 jam, sampel darah (~50ul) diambil dari hujung ekor setiap 2 minggu dengan meter glukosa darah dan kertas ujian (Johnson & Johnson, New Brunswick, NJ, Amerika Syarikat) untuk menentukan tahap glukosa darah . Selepas 10 minggu campur tangan, tikus telah dibius dengan suntikan intraperitoneal dengan 2 peratus natrium pentobarbital (syarikat Shanghai Harvest, Shanghai, Republik Rakyat China) (100mg/kg). Darah dikumpulkan selepas kemasukan jarum kapilari dan serum dipisahkan dengan cepat dan disimpan pada -80 darjah untuk analisis. Berikutan perfusi jantung dengan sejuk- PBS untuk mengeluarkan darah, PBS percuma dikeluarkan dengan kertas penapis. Tisu jantung dipisahkan dan ditimbang, dan berat kering jantung diukur. Perut tikus dicukur, perut dibuka selepas pembasmian kuman alkohol (70 peratus), dan tisu lemak subkutaneus perut cepat dibuang dan ditimbang basah. Tibia tikus diasingkan dan diukur. Hipertrofi jantung dinilai melalui nisbah berat jantung kepada panjang tibial (HW/TL) (mg/mm). Tisu jantung telah diperbaiki dengan 4 peratus paraformaldehid (bioteknologi Google, Wuhan, Republik Rakyat China) dan biopsi dilakukan untuk memantau morfologi tisu miokardium. Tisu jantung yang tinggal diletakkan dalam nitrogen cecair selama 1 jam dan disimpan pada -80 darjah sebelum analisis RT-PCR dan Western blot.

Ekokardiografi

Ultrasound (VisualSonics, Toronto, ON, Kanada) dilakukan untuk pengukuran ekokardiografi pada akhir eksperimen. Tikus telah dibius dengan suntikan intraperitoneal 4 peratus kloral hidrat pada 30mg/kg selama setengah jam,21 dicukur untuk mendedahkan kawasan dada, dan dipasang pada pinggan rata. Diameter sistolik ventrikel kiri (DVD), diameter diastolik LV (LVD), pecahan ejeksi LV (EF), dan pemendekan pecahan LV (FS) ditentukan.

Parameter Metabolik dan Biokimia

Pada usia 18 minggu, sampel darah disentrifugasi pada 4 darjah selama 20 minit untuk pengumpulan serum. Jumlah penganalisis biokimia automatik (ADVID2400, Tokyo, Jepun) digunakan untuk mengesan jumlah kolesterol (TC), trigliserida (TG), asid lemak bebas (FFA), lipoprotein-kolesterol berketumpatan tinggi (HDL- c), dan ketumpatan rendah lipoprotein-kolesterol (LDL-c) dalam serum.

Anti-pengoksidaan: cistanche tubulosa

Indeks Pengoksidaan dan Tahap Antioksidan

Tisu miokardium ventrikel kiri segar (50 mg) setiap kumpulan diperolehi. Tahap SOD, GSH-px, dan MDA dalam sel miokardium ditentukan menggunakan kit komersial (Nanjing Jiangcheng Bioengineering Institute, China).

Pewarnaan Trichrome, Tunel, dan Sudan II Kawasan ventrikel kiri tisu miokardium setiap kumpulan tikus telah ditetapkan dalam 4 peratus paraformaldehid selama 24 jam, dibenamkan parafin, dipotong dan diwarnakan HE. Perubahan patologi dan morfologi gentian miokardium setiap kumpulan tikus diperhatikan di bawah mikroskop cahaya (JEOL, Tokyo, Jepun). Apoptosis myocyte jantung telah dikesan oleh ujian Tunel (nombor 11684817910, Roche, Amerika Syarikat). Tisu jantung telah dirawat terlebih dahulu dengan paraformaldehid, dibenamkan dan dihiris. Bahagian telah dibasuh dengan xilena I (Shanghai, Republik Rakyat China) (20 min) -xylene II (20 min) -etanol kontang I (10 min) -etanol II kontang (10 min) −95 peratus alkohol (5 min){{ 14}} peratus alkohol (5 min)-80 peratus alkohol (5 min) −70 peratus alkohol (5 min) dan air suling. Bahagian telah dikeringkan melalui goncangan dan cincin berus histokimia digunakan untuk mengelakkan kehilangan cecair. Protease K telah ditambahkan pada cincin untuk menutup tisu. Selepas pengeraman pada 37 darjah selama 15 minit, slaid diletakkan dalam PBS (pH 7.4) dan dibasuh dalam shaker penyahwarna (tiga kali selama 5 minit). Reagen 1 (TdT) dan 2 (dUTP) dicampur pada nisbah 1:9 dan ditambah pada penutup dalam tisu. Campuran diinkubasi dalam tab mandi air pada suhu 37 darjah selama 60 minit. Sebilangan kecil air ditambah untuk mengekalkan kelembapan. Slaid dibilas dalam PBS dan diwarnakan DAPI (biologi Aspen, Wuhan, Republik Rakyat China) dalam gelap selama 5 minit. Slaid dibilas dalam PBS dan dipasang menggunakan agen pelindapkejutan anti-pendarfluor. Bahagian telah divisualisasikan oleh mikroskop pendarfluor dan diimej. Pewarnaan Sudan II digunakan untuk memerhatikan pengumpulan lipid dalam miosit jantung. Tisu ventrikel kiri telah ditetapkan dalam 10 peratus paraformaldehid selama 30 minit, diwarnai dengan Sudan merah II (Gefen, Shanghai, Republik Rakyat China) pada suhu bilik selama 10 minit, dinyahwarna dengan 75 peratus alkohol, dan diwarnakan semula dalam PBS selama 15 minit . Nisbah fibrosis miokardium kepada jumlah kawasan dalam bahagian trichrome berwarna Masson ditentukan menggunakan perisian kuantitatif Image-Pro Plus. Slaid telah dipasang menggunakan gelatin gliserin dan digambarkan melalui mikroskop.

Keputusan

Kesan ECH pada Tikus Db/Db

Tikus dalam kumpulan db/db menunjukkan polifagia dan poliuria yang jelas. Saiz badan juga jauh lebih besar daripada tikus db/m. Berat badan dalam kumpulan db/db meningkat dengan ketara berbanding kumpulan db/m (Rajah 1A; **p<0.01). body="" weights="" of="" the="" db/db="" +="" ech="" group="" were="" significantly="" lower="" than="" those="" of="" the="" db/="" db="" group="" after="" 10="" weeks="" of="" ech="" treatment="" (figure="" 1a;=""><0.05). at="" week="" 15,="" the="" difference="" in="" body="" weight="" of="" each="" group="" gradually="" appeared="" after="" ech="" intervention.="" the="" abdominal="" fat="" thickness="" of="" mice="" in="" the="" db/db="" group="" was="" higher="" than="" those="" in="" the="" db/m="" group="" (figure="" 2b;=""><0.01). ech,="" therefore,="" improves="" obesity="" in="" db/db="" mice,="" the="" specific="" mechanisms="" of="" which="" require="" further="">

Tahap glukosa darah puasa dinilai setiap minggu. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1B, berbanding dengan tikus db/m, paras glukosa darah berpuasa bagi tikus db/db meningkat dengan ketara dengan usia dan menunjukkan hiperglikemia yang jelas (Rajah 1B; *p<0.01). over="" a="" 10="" week="" period,="" fasting="" blood="" glucose="" levels="" in="" the="" db/db="" and="" db/db="" +="" ech="" group="" increased,="" whilst="" glucose="" levels="" in="" the="" db/m="" group="" remained="" stable.="" fasting="" blood="" glucose="" levels="" in="" the="" db/="" db="" +="" ech="" group="" were="" slower="" than="" those="" of="" the="" db/db="" group="" (figure="" 1b;=""><0.01), suggesting="" that="" ech="" markedly="" improved="" hyperglycemia="" in="" db/db="" diabetic="" mice.="" we="" speculated="" that="" ech="" could="" promote="" the="" synthesis="" of="" liver="" glycogen="" and="" inhibited="" the="" activity="" of="" α-glucosidase="" to="" suppressed="" glucose="" transport="" in="" the="" small="" intestine,="" significantly="" contributing="" to="">

Perbincangan

Kardiomiopati diabetik secara amnya dibahagikan kepada empat peringkat. Pada peringkat pertama, jisim ventrikel kiri meningkat, disfungsi diastolik dan pecahan ejeksi (EF) normal. Walaupun secara klinikal tanpa gejala, fibrosis miokardium meningkat, pengisian diastolik awal berkurangan, dan tekanan akhir diastolik ventrikel kiri meningkat.22 Peringkat kedua dicirikan oleh peningkatan jisim ventrikel kiri, dinding ventrikel yang menebal, disfungsi sistolik dan diastolik (EF).<50%), mild="" cardiac="" dilatation.="" in="" the="" third="" stage,="" diastolic="" dysfunction="" and="" arterial="" hypertension="" contribute="" to="" systolic="" dysfunction="" and="" microangiopathy.="" stage="" iv,="" moderate-severe="" systolic="" dysfunction,="" cardiac="" dilatation,="" fibrosis,="" and="" microvascular="" and="" macrovascular="" lesions="" cause="" severe="" and="" irreversible="" changes="" in="" heart="" tissue="" ultimately.26="" myocardial="" cell="" apoptosis,="" necrosis,="" hypertrophy,="" and="" fibrosis="" increase="" leading="" to="" disorders="" of="" diastolic="" and="" systolic="" functioning.6,27="" this="" eventually="" develops="" into="" ischemic="" heart="" disease="" and="" heart="" failure.28="" in="" this="" study,="" blood="" glucose="" and="" serum="" lipid="" levels="" of="" db/db="" mice="" significantly="" increased="" in="" the="" db/db="" group.="" symptoms="" of="" obesity="" were="" also="" observed,="" including="" body="" weight="" changes="" and="" increases="" in="" the="" rate="" of="" hw/tl="" compared="" to="" the="" db/m="" group.="" he="" staining="" and="" masson's="" trichrome="" staining="" of="" the="" heart="" showed="" obvious="" pathological="" changes="" in="" the="" cardiac="" myocytes="" of="" the="" db/db="" group,="" including="" hypertrophy="" and="" necrosis,="" disordered="" cardiac="" myocytes,="" and="" high="" levels="" of="" extracellular="" matrix="" deposition.="" these="" data="" indicate="" that="" db/db="" mice="" exhibit="" early="" dcm="" under="" long-term="">

ATP adalah sumber tenaga asas untuk jantung. Tenaga jantung disediakan oleh pengoksidaan dan penguraian FA, yang menyumbang ~70 peratus daripada bekalan tenaga jantung.29 Selebihnya disediakan oleh karbohidrat seperti glukosa dan asid laktik.30 Jantung diabetes tertakluk kepada peningkatan penggunaan tenaga dan ketidakseimbangan dalam kapasiti miokardium, mewakili punca utama gangguan metabolik miokardium, termasuk penurunan metabolisme glukosa dan peningkatan metabolisme FA. Ini membawa kepada peningkatan pengambilan dan pengoksidaan FA yang membawa kepada pengumpulan adiposa dan pembentukan bahan lemak toksik, secara langsung membawa kepada lesi DCM.31

Kesimpulan

Dalam tikus db/db dengan miokardium diabetik, metabolisme glukosa dan lipid tidak terkawal, membawa kepada peningkatan tahap tekanan oksidatif dan apoptosis. Kajian ini mengesahkan bahawa ECH boleh mengurangkan hiperglikemia jangka panjang dengan ketara dalam tikus db/db melalui isyarat PPAR/M-CPT-1/GLUT-4. Sementara itu, ECH meningkatkan tekanan oksidatif dan menghalang apoptosis miokardium dalam tikus DCM db/db, yang mungkin berkaitan dengan metabolisme tenaga yang lebih baik. Walaupun mekanisme asas yang mengawal kesan ini tidak ditemui, penemuan ini memberikan hala tuju baharu untuk rawatan DCM dan peranan perlindungan ECH dalam memperbaiki kecederaan miokardium.

Rujukan

1. Bauters C, Lamblin N, Mc Fadden EP, Van Belle E, Millaire A, de

Groote P. Pengaruh diabetes mellitus terhadap risiko kegagalan jantung dan hasil. Cardiovasc Diabetol. 2003;1(8):1–2. doi:10.1186/1475- 2840-2-1

2. Tate M, DJ Dukacita, Ritchie RH. Adakah terapi disasarkan untuk kardiomiopati diabetes di kaki langit? Clin Sci. 2017;131(10):897–915. doi:10.1042/CS20160491

3. Khan H, Anker SD, Januzzi JJ, et al. Epidemiologi kegagalan jantung pada pesakit diabetes mellitus tanpa penyakit jantung koronari. Kad J Gagal. 2019;25(2):78–86. doi:10.1016/j.cardfail.2018.10.015

4. Sheila K, Patel B. Gen CTGF −945 G/C polimorfisme tidak dikaitkan dengan komplikasi jantung atau buah pinggang dalam subjek dengan diabetes jenis 2. Cardiovasc Diabetol. 2012;1(11):42.