myBahasa
Rumah / Pengetahuan / Kandungan

Pengetahuan

Autofluorescence Sebagai Biomarker Noninvasive Senescence Dan Produk Akhir Glycation Termaju dalam Cistanche Tubulosa

Apr 11, 2023

PERBINCANGAN

Sebelum ini, autofluoresensi telah digunakan untuk memantau lipofuscin, pigmen umur, sebagai biomarker penuaan.4,13. Walaupun kami memerhatikan merahFlindikasi uorescence lipofuscin seperti yang dilihat dalam kajian terdahulu9, biruFluorescence dikesan pada peringkat awal kehidupan apabila cacing diperiksa menggunakan M165 FCFlstereomikroskop uorescence (Leica Microsystems, Tokyo, Jepun) (data tidak ditunjukkan). Tujuan kajian ini adalah untuk mengkaji sama ada autofluoresensi biru boleh berfungsi sebagai penanda yang lebih sensitif untuk mengesan penuaan cacing individu.

anti- senescence cistanche function

Cistanche UntukAnti-penuaan

Buy Cistanche

Produk Cistanche Anti-Penuaan Sedia Untuk Dihantar


TheFluorescence diukur dalam cacing individu meningkat dengan usia; semakin sedikit cacingFluoresced, semakin lama jangka hayat mereka. Oleh itu, biruFluorescence boleh menyediakan biomarker alternatif untuk mengesan penuaan. Walau bagaimanapun, Pincus et al. melaporkan bahawa cacing yang kemudiannya mati (dalam masa 24 jam)Fluoresced kerana biosintesis kynurenine; penyelidik itu menamakan cahaya biru ini"kematianflkecemerlangan". Khabarnya, kematianFlsemula uorescenceFlects pelepasan oleh bentuk glikosilasi asid anthranilic yang dihasilkan oleh laluan kynurenine; kereta ituFlbahan uorescing dikesan dalam butiran usus seperti lisosom31. Cahaya biru ini boleh menjadi penanda kematian yang sama dengan Coburn et al. diperhatikan dalamC. elegansselama beberapa jam sebelum dan selepas kematian, dan itu dilaporkan dilihat pada kedua-dua cacing muda yang mengalami kecederaan maut dan cacing mati secara semula jadi pada usia tua. Sesungguhnya, kami memerhatikan bahawajenis-1mutan, yang tidak mempunyai aktiviti kynureninase, adalah autofluorescent kurang daripada jenis liar. Walau bagaimanapun, keputusan kami menunjukkan bahawa beberapa bahagian biruFluorescence dikaitkan dengan penuaan dan bukannya dengan kematian. Terutama, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah.3b, cacing penuaan mempamerkan peningkatan warna biruFluorescence walaupun mengecualikan data yang diperolehi dalam tempoh 2 hari sebelum kematian. Tambahan pula, cacing masihFluoresced lebih dengan penuaan, tanpa mengira keadaankynu-1gen. DikurangkanFluorescence dalamkynu-1mutan sepatutnya disebabkan oleh kehilangan itupecutan sintesis AGE oleh kynurenines dan bukannya kekurangan kematianFlkecemerlangan32.


Sebatian AGE tertentu adalahFlunjuran27. Kami membuat kesimpulan bahawa biruFluorescence mungkin termasuk pelepasan daripada AGE tersebut, berasingan daripada yang boleh dikaitkan dengan kematianFlkecemerlangan. Apabila protein cacing yang diekstrak diinkubasi dengan gula secara in vitro,flkeamatan uorescence dan tahap AGE meningkat dari semasa ke semasa. Cacing dibiakkan pada medium yang mengandungi ribosaFlUoresced lebih daripada haiwan kawalan ditanam tanpa ketiadaan ribosa tambahan, walaupun apabilakynu-1telah bermutasi. Sebaliknya, cacing yang dibiakkan dengan kehadiran rifampicin, perencat pengeluaran AGE yang diketahui, menunjukkan penurunan tahap biru.Flkecemerlangan. Sesungguhnya, mikroskop pendarfluor menunjukkan bahawa 13-cacing berumur sehari memancarkan lebih banyak cahaya biru daripada 3-dewasa muda berumur sehari. Imunostaining dengan antibodi anti-CML atau anti-pentosidine gagal menunjukkan kehadiran AGE yang merebak secara meresap dalam corak pengedaran yang menyerupai warna biruFlkecemerlangan. TheFluorescence boleh berasal dari lain-lainFlAGE umorescent seperti vespertine A, LM-1 dan argpyrimidine33,34.


Untuk menyediakan kuning telur untuk ookista,C. eleganshermafrodit memakan biojisim usus mereka sendiri, yang mengakibatkan atrofi usus dan pemendapan kuning ektopik di kemudian hari. Vitellogenins (protein kuning telur) terdapat pada tahap dua kali ganda lebih tinggi dalam cacing tua (berbanding dengan haiwan yang lebih muda), seperti yang dilaporkan sebelum ini.35, dan mempamerkan enam kali ganda lebih besarFluorescence selepas glycation in vitro. Data ini mencadangkan bahawa vitellogenin sendiri akan menjana 12-kali ganda meningkatfluorescence pada cacing yang lebih tua berbanding dengan dewasa muda secara teorinya. Western blotting menunjukkan bahawa jalur utama yang bertindak balas dengan antibodi anti-CML ialah protein kuning. Penemuan ini sepadan dengan laporan sebelumnya Nakamura et al., yang mengesan glikasi berat vitellogenin36, dan Golegaonkar et al., yang mengesan penurunan glikasi dalam vitellogenin-2, vitellogenin-6 dan faktor pemanjangan 1 alfa dalam nematod yang dirawat rifampicin30. Dilaporkan, vitellogenin bertindak sebagai antioksidan dan menyumbang kepada umur panjang ratu lebah madu37. DalamC. elegans, vitellogenin memainkan peranan penting dalam rintangan tekanan 38. Oleh kerana antioksidan boleh teroksida dengan mudah sendiri, pengumpulan vitellogenin terglikasi boleh menjejaskan perlindungan daripada kerosakan oksidatif, mengakibatkan hubungan songsang antara jangka hayat dan keamatan biruFluorescence diperhatikan dalam kajian ini. Walau bagaimanapun, Sornda et al. baru-baru ini melaporkan bahawa jangka hayat tidak berkaitan dengan rintangan tekanan oksidatif yang dimediasi oleh YP115/YP88 (vitellogenin-6)39. Penyelidik tersebut mencadangkan bahawa pengumpulan vitellogenin YP170, yang diperoleh daripada vitellogenin 1–5, menyebabkan atrofi usus dan jangka hayat berkurangan, manakala pengumpulan YP115/YP88 mungkin melambatkan atrofi usus dan memanjangkan jangka hayat. Glycation vitellogenin-6 dan akibatnya disfungsi boleh menyumbang kepada penuaan. Walaupun faktor pemanjanganFlanda mengalami tiga kali ganda lebih sengit selepas glikasi in vitro, jumlah protein ini adalah serupa antara cacing muda dan tua. Oleh itu, sumbangan faktor ini kepada autofluoresensi yang dipertingkatkan mungkin lebih kecil daripada yang dikaitkan dengan vitellogenin.

anti- senescence cistanche function


Cistanchetelah digunakan secara amnya sebagai model untukbelajarintervensi penuaan dan anti-penuaan. Kami mencadangkan penggunaan cacing sebagai model untuk menyiasat kesan pro-panjang umurbakteria asid laktik8. Memandangkan demonstrasi (dalam kajian ini) biru ituflUorescence dalam nematod adalah penunjuk kemungkinan pengumpulan AGEs, kami mencadangkannyaCistanche hermafrodit boleh berfungsi sebagai model untuk menyiasat kegunaan campur tangan anti-penuaan yang bertindak melalui penindasan pengeluaran AGEs. Sebaliknya, autofluoresensi tidak mungkin menjadi biomarker penuaan untuk cacing jantan kerana vitellogenin mestilah terhad.

anti- senescence cistanche function

Rajah 5 Pendarfluor biru daripada kynu-1 mutan, yang tidak sepatutnya memancarkan pendarfluor maut. aKeamatan pendarfluor (ex 340/em 430) 7-hari dan 13-harikynu-1mutan (n = 37 setiap satu); cacing yang lebih tua masih mengeluarkan lebih banyakFluorescence daripada cacing yang lebih muda, walaupunkynu-1mutasi. Namun, tiada tandaFifiperbezaan cant dikesan dalam nilai autofluoresensi oleh Mann–WhitneyU ujian.b Seekor 7-cacing berumur sehari yang dikekalkan dengan ribosa mengeluarkan lebih biruFluorescence walaupunjenis-1mutasi. BiruFlkecemerlangan daripadaC. eleganstumbuh dengan ribosa (n = 24) atau sorbitol (n = 18) dibandingkan dengan cacing kawalan tanpa gula (n = 20). Nilai autofluoresensi dibandingkan menggunakan Keluli bukan parametrik–Kaedah Dwass (**p < 0.01). c Keluk hidupC. eleganstumbuh dengan ribosa (n = 62) atau sorbitol (n = 84) dibandingkan dengan cacing kawalan tanpa gula (n = 64). Cacing berumur 3 hari pada Hari 0. Kelangsungan hidup nematod dikira oleh Kaplan–Kaedah Meier, dan perbezaan kelangsungan hidup telah diuji untuk kepentingannya dengan menggunakan ujian peringkat log (**p < 0.01).


KAEDAH

NematodCistanche Strain Bristol N2 dan strain mutan derivatifnya telah disediakan oleh Pusat Genetik Caenorhabditis, Universiti Minnesota. Mutasi yang digunakan dalam kajian ini ialah CB1370daf-2 (e1370)dan CB1003kynu{0}} (e1003). Nematod dikekalkan dan dibiakkan pada NGM mengikut teknik standard 40. Telur cacing telah diperolehi daripada cacing dewasa selepas terdedah kepada larutan natrium hipoklorit/natrium hidroksida seperti yang diterangkan sebelum ini 41. Suspensi telur diinkubasi semalaman pada suhu 25 darjah untuk membolehkan penetasan, dan ampaian. daripada L{3}}cacing peringkat telah disentrifugasi pada 156 ×g selama 1 min. Supernatan dikeluarkan, dan larva yang tinggal dipindahkan ke plat NGM (mNGM) diubah suai bebas pepton segar yang ditutup denganE coliterikan OP50 (OP50). Terikan ditanam pada plat agar mNGM pada 25 darjah kecuali untukdaf-2terikan, yang ditanam pada 20 darjah hingga peringkat L4. Semua ujian dimulakan dengan cacing dewasa muda yang mula bertelur pada 25 darjah. Tiada kelulusan etika diperlukan untuk nematod.Strain bakteriaOP50 telah digunakan sebagai makanan nematod yang ditubuhkan di peringkat antarabangsa. Tryptone soya agar (Nissui Pharmaceutical, Tokyo, Jepun) digunakan untuk mengkultur OP50. Bakteria (100 mg berat basah) digantung dalam 0.5 mL penimbal M9; 50-µL aliquot penggantungan bakteria kemudiannya disebarkan pada mNGM dalam 5.5-plat berdiameter cm melainkan dinyatakan sebaliknya.


anti- senescence cistanche function

Analisis multivariate autofluoresensi

Populasi 100 orang dewasa setiap satu telah pulih pada usia 3 dan 17 hari,dibasuh tiga kali, pekat dalam 3 µL penimbal M9, dan disimpan bekudi–80 darjah sehingga digunakan. Sebelum pengekstrakan, 3 µL penimbal lisis (terdiri daripadaPenampan 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.1 peratus natrium dodesil sulfat(SDS), 1 peratus Triton X-100, 1 mM fenilmetilsulfonilFluoride (PMSF), dan
2 peratus 2-mercaptoethanol) dan 4 µL 15 peratus SDS telah diagihkan kepada setiap tiub. Sampel kemudiannya tertakluk kepadaFive kitaran beku-cair untuk membebaskan protein. Spektrum photoluminescent dikumpulkan dengan aFlkecemerlanganspektrofotometer (Hitachi FL{{0}}) dengan perisian pentafsiran data (FL Solutions ver. 2.0). Sifat pendarfluor suspensi nematod ialah

dianalisis menggunakan matriks pelepasan pengujaan (EEM)Flspektroskopi uorescence. Analisis multivariate (pengujaan panjang gelombang tunggal dengan pelbagaipelepasan panjang gelombang, dan pengimbasan segerakfluorometry) menghasilkan plot EEM yang terdiri daripada pengujaan imbasan tunggal, danpendarfluorspektrum setiap siri telah dilukis.



Spektrum pendarfluor cacing penuaan

Cacing (3–berumur 13 hari) diperoleh daripada medium pertumbuhan yang mengandungi 2'-deoksi-5-Fluorouridine (Industri Kimia Tokyo, Tokyo, Jepun). inisebatian menyekat perkembangan embrio keturunan, dengan itu menghalang pencemaran oleh keturunan. Cacing penuaan individu dikumpulkantiub, dibasuhlimakali, tertumpu dalam 3 µL penimbal M9, dan disimpan beku di–80 darjah sehingga digunakan. Sebelum pengekstrakan, 100 µL penimbal lisis(terdiri daripada penimbal Tris-HCl 50 mM (pH 7.5), 150 mM NaCl, 10 mM dithiothreitol (DTT), 1 mM PMSF, dan koktel perencat protease 1 µL (Sigma, St. Louis, MO, USA)) telah ditambah kepada setiap tiub. Sampel kemudian dikisar menggunakan Pengisar Tanpa Kord Mini (Fnakoshi, Tokyo, Jepun) untuk dikeluarkan
protein. Kandungan protein diukur secara kuantitatif menggunakan Pierce™ Reagen Ujian Protein 660 nm (Meridian Saintifik Thermo Fisher,Waltham, MA, USA) dan instrumen NanoDrop OneC (Thermo Fisher Scientific). Thependarfluorspektrum ditentukan untuk setiap 30-µL sampel (mengandungi 1.5μg jumlah protein) menggunakan parut berbilang mod

model pembaca plat mikro SH-9000Makmal dengan Perisian Rawatan Data SF6(Corona Electric, Ibaraki, Jepun). Setiap pengukuran dilakukan sebanyak tiga kali.


image

Pengukuran autofluoresensi cacing hidup individu (kaedah bungkus-jatuh)

Cacing yang dipilih secara rawak telah dibasuh dengan penimbal M9, dan kemudiancacing individu diletakkan dalam 1.0 µL penimbal M9 pada Saran Wrap clingFilm (Asahi Kasei, Tokyo, Jepun) terbentang di atas 384-plat hitam perigi(STEM, Tokyo, Jepun). Lubang kecil dibentuk pada setiap telaga menggunakan areplikator (Watson, Kobe, Jepun). Pengubahsuaian ini adalah untuk memulihkan cacing dengan selamat selepas pengukuran supaya perubahan autofluoresensi yang bergantung kepada umur setiap cacing dapat dikesan. Yang berpautFilm dipilih kerana ia auto-pendarfluor kurang daripada lain yang tersedia secara komersialFilms.

Walau bagaimanapun, data kosong (penampan M9 sahaja) telah diperiksa tiga kali untuksetiap sumur, memandangkanturun naikdari telaga ke telaga. Had pengesanan minimum dan had boleh diukur ditentukan berdasarkan data kosong pada setiap hari sebagaiμ (min tempat kosong)tambah lagi3.29σ (sisihan piawai) danμtambah lagi√2 × 10σ, masing-masing. Autofluoresensi dalam badan setiap cacing

telah ditangkap dengan pembaca plat mikro parut berbilang mod. Selepasukuran, setiap cacing dikekalkan secara individu pada 4.0-smplat diameter ditutup dengan OP50 (2 mg/10μL M9 penimbal) pada 25 darjah . setiap satuujian dijalankan ke atas sekurang-kurangnya 20 cacing dan diulang dua kali.


Pengukuran jangka hayat

Cacing dikekalkan pada plat mNGM yang ditutup dengan OP50 pada suhu 25 darjah sehingga 13 hari. Selepas penilaian olehpendarfluorassay, 30 cacing setiap satudipindahkan ke plat mNGM baharu yang berasingan yang ditutup dengan OP50. Plat diinkubasi pada 25 darjah, dan cacing hidup dan mati dijaringkan setiap 24 jam. Seekor cacing dianggap mati apabila ia gagal bertindak balas terhadap sentuhan lembut dengan pemetik cacing.

anti- senescence cistanche function


AGEs selepas glikasi in vitro

Pengekstrakan protein dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini. Cacing berusia tiga hari digunakan untuk glikasi buatan. Sampel protein (2 mg/mL)telah diinkubasi dengan 500 mM glukosa, 100 mM ribosa, atau 500 mM fruktosa(Fikepekatan akhir). Semua sampel telah diinkubasi pada 37 darjah untuk 0–4 minggu. Aliquots (50μL) disalurkan ke telaga plat polistirena
(Sumitomo Bakelite, Tokyo, Jepun) dan diinkubasi selama 2 jam pada suhu 37 darjah . Selepaspenyingkiran larutan sampel, plat dibasuh dengan PBS-T(garam penimbal fosfat (PBS), 0.05 peratus Tween 20); 250μL daripada 3 peratus susu skimtelah ditambah kepada setiap telaga, dan plat diinkubasi selama 2 jam pada 37 darjah. setiap satukemudian dibasuh dengan PBS-T, dan 100μL daripada anti-AGE (anti-CML)
antibodi monoklonal (Klon No. 6D12, Trans Genic, Fukuoka, Jepun; 75 ng/mL) telah disalurkan ke setiap telaga; pinggan kemudiannya diinkubasi di dalam biliksuhu selama 1 jam. Selepas mencuci dengan PBS-T, 100μL daripada peroksidase-konjugasiAntibodi IgG anti-tikus kambing (Rockland Immunochemicals, Inc., Limerick, PA, USA; 1:150,000) telah disalurkan ke setiap telaga dan
plat diinkubasi pada suhu bilik selama 1 jam. Selepas mencuci dengan PBS-T, 100μL larutan yang berfungsi (tetramethylbenzidine (TMB) larutan pewarnaan: larutan peroksida= 1:1; Kit TMB substrat ELISA POD, Popular,Nacalai Tesque, Kyoto, Jepun) telah disalurkan ke setiap perigi, dan pinggan itu dikekalkan pada suhu bilik dalam gelap sehingga pelindapkejutan oleh

penambahan 100μL daripada 1 mol/L asid sulfurik setiap telaga. Penyerapan masing-masingbaik pada 450 nm (sub: 650 nm) kemudian diukur serta-merta dengan pembaca plat mikro. ELISA dilakukan tiga kali untuk setiap keadaan ujian.


Western blotting untuk penuaan cacing

Sampel dirawat dengan 4× Bolt™ Penampan Sampel LDS (Thermo Fisher ScientiFific) dan 10× Bolt™ Ejen Pengurang Sampel (Thermo Fisher ScientiFific), dan setiap sampel mengandungi 1.5μg jumlah protein dijalankan pada Bolt™ 4–12 peratus Bis-Tris Plus Gel (Thermo Fisher ScientiFific). Kemudian protein dipindahkan dari gel ke polivinilidenaFlmembran uoride (ATTO, Tokyo, Jepun) dan disekat dengan 5 peratus susu skim dalam PBS- 0.1 peratus Antara 20 selama 1 jam. Membran diinkubasi semalaman pada suhu 4 darjah dengan antibodi monoklonal anti-AGE (anti-CML) (Klon No. 6D12 pada 1:1000), dibasuh dengan PBS-T dan kemudian diinkubasi pada suhu bilik selama 1 h dengan antibodi IgG anti-tikus kambing terkonjugasi peroksidase (1:25,000). Selepas dicuci dengan PBS-T, membran diinkubasi dengan reagen pengesanan blotting western prime ECL (GE Healthcare UK, Little Chalfont, England) dan diimbas menggunakan Sistem Pengimejan Sentuhan ChemiDoc (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) atau ImageQuant LAS 500 (GE Healthcare UK). Membran kemudian dibasuh dengan PBS-T, diinkubasi dengan Western BLoT Stripping Buffer (Takara, Shiga, Jepun) selama 30 minit pada suhu bilik, dan dibasuh semula dengan PBS-T. Membran diperiksa semula oleh antibodi anti-vitellogenin YP115 dan YP170 (setiap 1:10,000) pada 4 darjah sepanjang malam42, dibasuh dengan PBS-T, dan diinkubasi dengan antibodi IgG anti-tikus kambing berkonjugasi dengan peroksidase (1:2000) (Proteintech, Rosemont, IL, USA) pada suhu bilik selama 2 jam. Untuk kawalan pemuatan, membran telah disiasat semula menggunakan antibodi anti-aktin (Klon No. C4; Merck KGaA, Darmstadt, Jerman) dan antibodi anti-tikus terkonjugasi peroksidase (GE Healthcare UK). Ketumpatan vitellogenin (YP170 dan YP115) dan jalur CML dalam setiap lorong telah dinormalisasi berbanding jalur aktin di lorong masing-masing. Ketumpatan jalur dianalisis menggunakan perisian ImageQuant TL (GE Healthcare). Setiap ujian dilakukan dua kali.


Kesan ribosa dan rifampicin pada AGE dalam vivo

Cacing berumur tiga hari telah dibiakkan pada mNGM yang mengandungi 400 mM ribosaatau 400 mM sorbitol untuk dipadankan dengan osmolariti ribosa tinggi; makanan cacing disediakan sebagai haba (100 darjah, 10 min)-dibunuh OP50 untuk menghalang bakteria daripada menapai gula. Untuk mengelakkan pencemaran oleh keturunan, cacing dipindahkan ke pinggan segar setiap hari selama 4 hari sehingga mereka telah

selesaibertelur (pada umur 7 hari). Untuk menilai pengaruh ribosa, kami melakukan ujian survival dan mengukur autofluoresensi. Cacing adalahdianggap mati apabila ia gagal bertindak balas terhadap sentuhan lembut dengan pemetik cacing. Cacing yang mati akibat melekat pada dinding plat tidak termasuk dalam analisis dan ditapis. Dalam eksperimen berasingan,MGM mengandungi 50 µM (muktamadkepekatan) rifampicin (larut dalamDMSO) telah digunakan. Setiap ujian diulang dua kali.


anti- senescence cistanche function

Rajah 6 Auto-pendarfluor vitellogenin (Vit) dan faktor pemanjangan (EF). aSpektrofotometri (cth 325/em 350–600) daripada vitellogenin danfaktor pemanjangan sebelum dan selepas glikasi secara in vitro oleh ribosa selama 14 hari: gly-Vit dan gly-EF ialah vitelogenin terglikasi dan pemanjangan glikatfaktor, masing-masing. Riboflflavin (Rib) ditunjukkan sebagai wakilLFLkompaun uourescent. Ekstrak daripada 17-cacing berumur sehari (jenis liar N2) ditunjukkan sebagai perbandingan (C. elegans). b Pengglikatan in vitro vitellogenin dan faktor pemanjangan oleh ribosa menghasilkan peningkatan dalam autofluoresensi
lebih masa.c Analisis Western blotting AGE dan vitellogenin dalam sampel yang diekstrak daripada populasi cacing (jenis liar N2) yang berbeza umur. Blot diperoleh daripada gel yang sama dan diproses dengan setiap antibodi mengikut urutan.d Kuantifikasidaripada vitellogenin dan AGEs dari baratblotting menggunakan densitometri. Percubaan telah diulang dua kali, dan data daripada percubaan perwakilan ditunjukkan. Kedua-dua garisan dan garis putus-putus dalam warna merah menunjukkan perubahan lipatan AGEs, manakala yang dalam warna hitam menunjukkan jumlah vitellogenin. Bulatan tertutup dan pangkah adalah untuk data jalur yang sepadan dengan YP170 dan YP115, masing-masing


Pengenalpastian protein khusus cacing lama

Analisis spektrometri jisim ekstrak daripada 3- dan 17-nematod berumur seharitelah dilakukan pada spektrometer jisim AB SCIEX 5800 LC-MALDI-TOF (Newark, NJ, USA) dengan Protein Pilot versi 4.0. Kedua-dua matriks adalahdicerna oleh tripsin dan dicampur dengan larutan matriks (7 mg/L daripada - siano-4-asid hidroksisinamik dalam 0.1 peratus (v/v) asid trifluoroacetik (TFA), 70 peratus
(v/v) asetonitril (ACN)). Thesesamakadar yang digunakan untuk pengasingan ialah 300ML/min,dan pengasingan dicapai menggunakan kecerunan linear dua fasa mudah alih ({{0}}.1 peratus (v/v) TFA dalam 2 peratus ACN (pelarut A) dan 0.1 peratus (v/v) TFA dalam 80 peratus ACN(pelarut B)) dalam perkadaran berikut: A/B= 100/0–50/50 (60 min), A/B= 50/50–0/100 (20 min), A/B= 0/100 (10 min). Sistem Jisim MALDI-TOF digunakan untuk mendapatkan jisim peptidacap jari. Padanan peptida dancarian protein telah dilakukan terhadap pangkalan data Swiss-Prot versi 57.0 pangkalan data.


Protein yang diekstrak telah dibubarkan dalam 50 mM ammonium bikarbonat(AmBic) untuk menghasilkan kepekatan protein antara 0.1 dan 1 µg/µL. Untuk memaksimumkan keterlarutan protein, isipadu Air yang dikiraRapigest (Waters Corporation, Milford, MA, USA) telah ditambah kepada hasilFikepekatan akhir 0.1–0.2 peratus Rapigest dalam sampel pra-pencernaan. Sampel
dipanaskan pada 40 darjah dengan goncangan selama 10 minit; kandungannya ketika itudisentrifugasi, dan pelet yang terhasil digantung dalam AmBic yang mengandungi 10 mM DTT. Sampel dipanaskan pada suhu 80 darjah selama 15 minit dan dipelet pada suhu bilik. Alikuot 200 mM iodoacetamide (IAM) dalam 50 mMAmBic telah ditambahkan pada setiap sampel untuk menghasilkan amuktamadKepekatan IAM daripada

20 mM (dengan kehadiran lebihan 2x molar DTT); campuran itu adalahdiinkubasi dalam gelap pada suhu bilik selama 30 minit untuk membenarkan tindak balas alkilasi diteruskan. Trypsin dalam 50 mM AmBic dicampur dengan setiap larutan pada 1:50 (trypsin: kepekatan protein). Sampel dicerna selama sekurang-kurangnya 4 jam atau semalaman pada suhu 37 darjah dengan goncangan. Mengikutisentrifugasi, TFA dan ACN telah ditambah untuk menghasilkanmuktamadkepekatan 0.5–1.0 peratus TFA dan 2 peratus ACN mengikut volum. Sampel digoncang selama 2 jam pada suhu 60 darjah . Selepas sentrifugasi pada 22,200 ×g selama 5 minit, supernatan adalahdipipet ke dalam vial autosampler. Protein telah dicerna dengan tripsin sebelum inikepada analisis melalui kromatografi cecair fasa terbalik menggunakan sistem Ultimate3000RSnanoLC (Thermo Fisher Scientific) digandingkan dengan sistem ESI-Q-TOF (Impact II Bruker Daltonics). Ragi alkohol dehidrogenaseProtein (ADH1_YAST) telah dicucuk dalam sampel sebagai standard dalaman;spiking dilakukan untuk menyediakan kuantiti kira-kira 50 fmolstandard pada lajur.


Autofluoresensi selepas glikasi in vitro

Vitellogenin dalam larutan PBS ({{0}}.053 µM) telah dibeli daripada Biosense Laboratories AS (Bergen, NORWAY). Penyelesaian faktor pemanjangan (1.17 µM) telah dibeli daripada Abnova Corporation (Taipei City, Taiwan). Penyelesaian ini telah diglikasikan dengan 0.1 mM ribosa selama 23 hari pada 37 darjah. RiboFLFLavin telah dibeli dari Sigma (Tokyo, Jepun) dan dibubarkan dalam PBS pada 0.1 mM. Setiap penyelesaian diukur dengan spektrofotometri pendarfluor di bawah keadaan yang sama.

Imunofluoresensioleh cacing muda dan tuaCB1003 yang disegerakkan umur yang diberi makan OP50 diinkubasi pada 25 darjah . Dewasa berumur tiga hari dan 13-hari telah meresap menggunakan Bouin's protokol penetapan tiub43.


anti- senescence cistanche function

Rajah 7 Imej pendarfluor bagi mutan 3-day-old dan 13-day-old kynu-1. a–cCacing berumur tiga hari dand–f 13-cacing berumur sehari, dengan imej mentah dalam lajur 1. Untuk mengecualikan kemungkinan kesan kematianFluorescence yang bermula dari 2 hari sebelum cacing' kematian, mutankynu-1telah digunakan. Autopendarfluor dilihat dalam imej dalam lajur 2 dan 3. Foto dalam lajur 3 telah dibesarkan daripada kawasan yang ditunjukkan (oleh segi empat tepat) bagi imej dalam lajur 2. Cacing tua (13-hari) automatikberpendarfluorsigniFifilebih tinggi daripada cacing muda (3-umur sehari). Setiap bar skala menunjukkan 50μm. g Kuantifikasidaripada birupendarfluormenggunakan perisian ImageJ dan ImageQuant TL. Setiap bar mewakili nilai purata bagiFlkeamatan uorescence setiap 1 mm2 daripada sembilan cacing. ** menunjukkan tanda statistikFifitidak dapat membezakan antara 3-cacing berumur sehari dan 13-hari pada ap nilai < 0.01. Bar ralat mewakili SE.

Sampel adalahtetapdi Bouin's fiksatifdengan metanol/ -mercaptoethanolpada suhu bilik selama 30 min. Untuk memecahkan kutikula, cacing diletakkanisopropanol dan disimpan di–80 darjah selama 10 minit, kemudian diinkubasi pada suhu bilik selama 30 minit lagi. Thefiksatiflarutan telah dikeluarkan dandigantikan dengan larutan BTB (penampan borat 25 mM, 0.5 peratus Triton X-100, 2 peratus
-mercaptoethanol) pada suhu bilik selama 1 jam; pengeraman dalam BTB adalahdiulang sebanyak tiga kali. Cacing kemudian dipindahkan dari BTB ke BT (25 mM penimbal borat, 0.5 peratus Triton X-100), diinkubasi dalam larutan penimbal antibodi (1× PBS, 0.5 peratus Triton X-100, 0.1 mM EDTA, {{10}}.1 peratus albumin serum lembu (BSA), 0.05 peratus natrium azida, pH 7.2) pada suhu bilik untuk

1 jam, dan disekat dengan larutan penimbal antibodi yang mengandungi 10 peratus serum kambing(Cosmo Bio, Tokyo, Jepun) pada 4 darjah semalaman. Antibodi utama terdiri daripada antibodi anti-AGE (anti-CML) monoklonal tikus (Klon No. 6D12; 1:125) dan antibodi anti-pentosidin (Klon No. PEN-12, Trans Genic; 1:5 0). Antibodi sekunder terdiri daripada antibodi anti-tikus kambing konjugat Alexa Fluor 555- (Abcam, Cambridge, England; 1:100). Semua pencairan antibodi dilakukan menggunakan penimbal antibodi yang mengandungi 0.5 peratus BSA. Sampel telah dipasang pada slaid kaca menggunakan medium pelekap antiludar VECTASHIELD (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA).



Mikroskopi pendarfluor

Imej pendarfluor 3- atau 13-cacing dewasa berumur sehari, yang dipasang pada slaid kaca seperti yang diterangkan di atas, telah dirakam menggunakan terbalikFlkecemerlanganmikroskop (BZ-X700; Keyence) dengan kanta objektif 10× (CFI Plan Fluor DL10×/0.30). AutoFLFLuorescence cacing an merahpendarfluordaripada AlexaFluor 555 dilihat dengan BZ-X DAPI (panjang gelombang pengujaan (Ex), 360 ± 20 nm; panjang gelombang pelepasan (Em), 460 ± 25 nm) dan TRITC (Ex, 545 ±12.5 nm; Em, 605 ± 35 nm)penapis, masing-masing. Imej bahagian adalahditangkap oleh mod Pembahagian dengan jenis celah satu dimensi dengan alebar 32, dan pic tindanan Z 0.7μm untuk 40-μsampel tebal m. Untuk mengukur warna birupendarfluor, yangpendarfluorkeamatan diukur dengan Imej
Perisian Quant TL (GE Healthcare) telah dinormalisasi kepada nilai ketumpatan setiap 1 mm2 daripada seekor cacing's kawasan unjuran. Saiz badan ditentukan dengan perisian Adobe Photoshop Elements dan ImageJ yang dibangunkan oleh National Institutes of Health. Dalam sistem ini, kawasan cacing'unjurandianggarkan secara automatik dan digunakan sebagai indeks saiz badan.



Analisis statistik

Korelasi jangka hayat dikira menggunakan Spearman'pekali korelasi pangkat s. Tahap autofluoresensi selepas glikasi in vitro dibandingkan menggunakan ANOVA faktorial dua faktor dan Scheffe's F ujian. TheNilai ELISA selepas glikasi in vitro dibandingkan menggunakan ANOVA faktor tunggal dan ujian Dunnett untuk pelbagai perbandingan. Kelangsungan hidup nematodtelah dikira oleh Kaplan–Kaedah Meier, dan perbezaan kelangsungan hidup telah diuji untuk kepentingannya dengan menggunakan ujian peringkat log. Nilai autofluoresensi berikutan rawatan rifampicin dan penuaandaf-2dankynu-1mutan dibandingkan untuk setiap menggunakan Pelajar's t ujian, pengukuran berulang ANOVA dua faktor, dan Mann–WhitneyU ujian. Nilai autofluoresensi berikutan rawatan ribosa untuk N2 ataukynu-1mutan dibandingkan menggunakan Keluli bukan parametrik–Kaedah Dwass. Ketumpatan daripada mikroskop autofluoresensi dibandingkan menggunakan Student's ujian-t. Di mana kepentingan diperhatikan, data adalah classiFified sebagai *p < 0.05 and **p < 0.01. All analisis statistik telah dilakukan dengan Microsoft Excel ditambah denganperisian tambahantambah lagiStatcel 3 (OMS, Tokyo, Jepun) dan JSTAT untuk Windows(Nankodo, Tokyo, Jepun).


Ringkasan pelaporan

Maklumat lanjut mengenai reka bentuk penyelidikan boleh didapati di Nature ResearchRingkasan Pelaporan dipautkan kepada artikel ini.


KESEDIAAN DATA

Set data yang dijana semasa kajian semasa boleh didapati daripada korespondenpengarang atas permintaan yang munasabah.



RUJUKAN

1. Brenner, S. Genetik bagiCaenorhabditis elegans. Genetik 77, 71–94 (1974).
2. Teka-teki, DL, Blumenthal, T., Meyer, BJ, Priess, JR (eds.).C. elegans II. (SejukAkhbar Makmal Spring Harbor, Cold Spring Harbor, 1997).
3. Herndon, LA et al. Faktor stokastik dan genetik mempengaruhi penurunan khusus tisu dalam penuaanC. elegans. Alam Semula Jadi 419, 808–814 (2002).
4. Kelas, MR Penuaan dalam nematodCaenorhabditis elegans: faktor biologi dan persekitaran utama yang mempengaruhi jangka hayat.Mech. Dev Penuaan. 6, 413–429 (1977).
5. Son, HG, Altintas, O., Kim, EJE, Kwon, S. & Lee, SV Perubahan bergantung pada usia dan penanda bio penuaan dalamCaenorhabditis elegans. Sel Penuaan 18, e12853 (2019).
6. Yoshino, J., Mills, KF, Yoon, MJ & Imai, S. Nicotinamide mononucleotide, kunci NAD(tambah lagi) perantaraan, merawat patofisiologi diabetes akibat diet dan usia pada tikus.Metab Sel. 14, 528–536 (2011).
7. Denzel, MS, Lapierre, LR & Mack, HID Topik yang muncul dalamC. eleganspenyelidikan penuaan: peraturan transkrip, tindak balas tekanan dan epigenetik.Mech. Umur dalam Dev. 177, 4–21 (2019).
8. Ikeda, T., Yasui, C., Hoshino, K., Arikawa, K. & Nishikawa, Y. InFLFLpengaruh bakteria asid laktik pada umur panjangCaenorhabditis elegansdan pertahanan tuan rumah terhadap Salmonellaenterikserovar Enteritidis.Appl. alam sekitar. mikrobiol. 73, 6404–6409 (2007).
9. Komura, T., Ikeda, T., Yasui, C., Saeki, S. & Nishikawa, Y. Mekanisme yang mendasari pro-umur panjang yang disebabkan oleh bifidobakteria dalamCaenorhabditis elegans. Biogerontologi 14, 73–87 (2013).
10. Clark, LC & Hodgkin, J. Komensal, probiotik dan patogen dalamCaenorhabditis elegansmodel.Mikrobiol Sel. 16, 27–38 (2013).
11. Cabreiro, F. & Gems, D. Cacing juga memerlukan mikrob: mikrobiota, kesihatan, dan penuaan dalamCaenorhabditis elegans. EMBO Mol. Med. 5, 1300–1310 (2013).
12. Kim, Y. & Mylonakis, E.Caenorhabditis elegansPengkondisian imun dengan bakteria probiotikLactobacillus acidophilusketegangan NCFM meningkatkan tindak balas imun Gram-positif.Jangkitan. imun. 80, 2500–2508 (2012).
13. Gerstbrein, B., Stamatas, G., Kollias, N. & Driscoll, M. In vivo spectrofluorimetrymendedahkan biomarker endogen yang melaporkan jangka kesihatan dan sekatan diet dalamCaenorhabditis elegans. Sel Penuaan 4, 127–137 (2005).
14. Coburn, C. et al. Anthranilatependarfluormenandakan gelombang nekrotik yang disebarkan kalsium yang menggalakkan kematian organisma dalamC. elegans. PLoS Biol. 11, e1001613 (2013).
15. Pincus, Z., Mazer, TC & Slack, FJ AutoFLFLuorescence sebagai ukuran penuaan dalamC. elegans: lihat kepada merah, bukan biru atau hijau.Penuaan (Albany NY) 8, 889–898 (2016).
16. Sebekova, K. & Sebekova, KB Protein terglikasi dalam pemakanan: kawan atau lawan?Exp. Gerontol. 117, 76–90 (2019).
17. Giacco, F. & Brownlee, M. Tekanan oksidatif dan komplikasi diabetes.Peredaran Res. 107, 1058–1070 (2010).
18. Srikanth, V. et al. Produk akhir glikasi lanjutan dan reseptornya RAGE dalam Alzheimer's penyakit.Neurobiol. Penuaan 32, 763–777 (2011).
19. Zhuo, Q., Yang, W., Chen, JY & Wang, Y. Sindrom metabolik bertemu dengan osteoar thritis.Nat. Rev. Rheumatol. 8, 729–737 (2012).
20. Gkogkolou, P. & Bohm, M. Produk akhir glikasi lanjutan: pemain utama dalam penuaan kulit?Dermatoendokrinol 4, 259–270 (2012).
21. Liu, J. et al. Reseptor untuk produk akhir glikasi lanjutan menggalakkan pramatangpenuaan sel epitelium tiub proksimal melalui pengaktifan endoplasmaisyarat p21 bergantung kepada tekanan retikulum.Isyarat Sel 26, 110–121 (2014).

22. Mendler, M., Schlotterer, A., Morcos, M. & Nawroth, PP Memahami polineuropati diabetik dan umur panjang: apa yang boleh kita pelajari daripada nematodCae norhabditis elegans? Exp. Clin. Endokrinol. Diabetes 120, 182–183 (2012).


Minta lebih lanjut:

E-mel:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp tambah 86 15292862950


























Anda mungkin juga berminat