Tegasan Ricih Apical Pengangkutan Kation Organik Dipertingkatkan dalam Manusia OCT2/MATE1-Sel Ginjal Anjing Madin-Darby yang Ditransmisikan Melibatkan Penderiaan Siliari

Untuk maklumat lanjut:emily.li@wecistanche.com

Aishwarya Jayagopal, Paul R. Brakeman, Peter Soler, Nicholas Ferrell, William Fissell, Deanna L. Kroetz, dan Shuvo Roy

Jabatan Kejuruteraan Bio dan Sains Terapeutik (AJ, PS, DLK, SR) dan Pediatrik (PRB),

Universiti California San Francisco (UCSF), San Francisco, California;

dan Jabatan Perubatan, Bahagian Nefrologi, Pusat Perubatan Universiti Vanderbilt, Nashville, Tennessee (NF, WF)

ABSTRAK

Pengangkutan aktif olehbuah pinggangtubul proksimal memainkan peranan penting dalam pelupusan dadah. Semasa pembangunan dadah, anggaran bagibuah pinggangperkumuhan adalah penting untuk penentuan dos. Bioreaktor buah pinggang yang menghasilkan semula sepupu fisiologi buah pinggang, seperti tegasan ricih akibat aliran, mungkin lebih baik meramalkan tingkah laku dadah in vivo daripada model in vitro semasa. Dalam kajian ini, kami menyiasat peranan tegasan ricih pada pengangkutan aktif 4-(4-(dimethylamino)-styryl)-N-methyl pyridinium iodide (ASP plus )oleh anjing Madin-Darby.buah pinggangselmengekspresikan secara eksogen pengangkut kation organik manusia pengangkut kation organik 2(OCT2) dan protein penyemperitan multidrug dan toksin 1(MATE1). Sel-sel yang dibiakkan dalam plat selari di bawah perfusi media berterusan membentuk lapisan tunggal yang ketat dengan penghalang tinggi kepada inulin. Sebagai tindak balas kepada peningkatan tahap tegasan ricih (0.2-2 dynes/cm), sel menunjukkan peningkatan yang sepadan dalam pengangkutan ASP tambah , mencapai maksimum 4.2-peningkatan kali ganda pada 2 dynes/cm² berbanding dengan sel yang dikultur dalam keadaan statik. Pengangkutan ini telah dihalang dengan imipramine, menunjukkan pengangkutan aktif hadir di bawah keadaan tegasan ricih. Sel yang terdedah kepada tegasan ricih sebanyak 2 dyne/cm² juga menunjukkan peningkatan dalam ekspresi RNA kedua-dua manusia yang ditransfeksi dan OCT2 endogen(3.7- dan 2.0-lipat, masing-masing). Penyingkiran silia oleh ammonium sulfat menghapuskan kesan ricih pada ASP tambah pengangkutan pada 0.5 dynes/cm² tanpa kesan pada ASP tambah pengangkutan dalam keadaan statik. Keputusan ini menunjukkan bahawa tegasan ricih mempengaruhi pengangkutan aktif kation organik dalambuah pinggangtiubsel epitelium dalam cara yang bergantung kepada silia.

Cistanche baik untuk fungsi buah pinggang

pengenalan

Walaupun kemajuan besar dalam kaedah praklinikal untuk pemilihan calon ubat yang optimum, pembangunan ubat kekal sebagai proses yang panjang dan mahal yang mempunyai hasil yang sangat rendah bagi entiti molekul baharu yang dipasarkan (Watkins, 2011). Kekurangan utama model praklinikal ialah ketidakupayaan untuk meramalkan pelepasan dan ketoksikan pada manusia. Kira-kira 30 peratus daripada ubat yang berjaya dalam kajian praklinikal gagal pada manusia akibat nilai pelepasan atau ketoksikan yang tidak dijangka (Kola dan Landis, 2004).

Buah pinggang adalah sasaran yang sangat penting untuk pemodelan kultur sel in vitro kerana ia bertanggungjawab untuk penyingkiran lebih daripada satu pertiga daripada semua ubat dan kebanyakan metabolit (Morrissey et al., 2013). Thebuah pinggangtubul proksimal adalah penting untuk ujian dadah semasa pembangunan kerana ia melakukan kebanyakan pengangkutan aktif calon dadah dan sangat sensitif terhadap kecederaan toksik (Giacominiet al., 2010). Thebuah pinggangtubulialah satu lapisan sel epitelium dengan turasan yang mengalir merentasi permukaan apikal. Membran bawah tanah mendasari epitelium tiub, dan kapilari peritubular bersebelahan membenarkan penyerapan semula air dan salut. Persekitaran mikro tubul proksimal, terutamanya tegasan ricih cecair dan kecerunan onkotik apicobasal, dihasilkan semula secara tidak lengkap oleh teknik kultur sel konvensional. Bioreaktor sel epitelium yang menangkap fisiologi in vivo yang menonjol boleh meningkatkan ketepatan ramalan pelepasan dan ketoksikan yang diperoleh daripada ujian in vitro (Pfaller dan Gstraunthaler, 1998; Astashkina et al., 2012).

Bukti yang semakin meningkat menunjukkan bahawa morfologi dan kefungsian sel tubul proksimal boleh berbeza-beza mengikut persekitaran pertumbuhan, seperti keliangan permukaan pertumbuhan, pendedahan kepada bendalir pada kedua-dua belah dan/atau tegasan ricih bendalir. Kerja sebelumnya dari Essig dan Friedlander(2003), serta dari makmal kami (Ferrell et al.2010), telah menunjukkan bahawa penyusunan semula akibat aliran bendalir tiub dalam sitoskeleton aktin apikal sel tubul proksimal (Ferrell et al., 2010) . Selepas itu, beberapa kajian telah menunjukkan bahawa tegasan ricih mempengaruhi tahap ekspresi dan penyetempatan berbilang pengambilan dan pengangkut efluks, termasuk antiporter natrium-hidrogen 3. Na/K-ATPase, pengangkut glukosa, saluran natrium epitelium, dan reseptor endositosis, megalin dan tubulin. (Duan et al.,2010; Raghavan et al.,2014; Jansen et al..2016; Ernandez et al.,2018). Kerja lain telah menunjukkan bahawa aliran ricih dalam sistem bioreaktor tiub berorientasikan dan memanjangbuah pinggangtiubsel di sepanjang laluan aliran (Venzac et al. 2018). Bukti in vitro menunjukkan bahawa beberapa perubahan dalam struktur sitoskeletal dan fungsi pengangkutan berkemungkinan berkaitan dengan fungsi mekanosensori silia (Overgaard et al.. 2009; Raghavan et al..2014); walau bagaimanapun, beberapa kajian telah mempertimbangkan kesan tegasan ricih ke atas pengangkut ubat dalam sel buah pinggang. Tambahan pula, sedikit yang diketahui tentang kesan kadar ricih yang berbeza pada kefungsian sel, terutamanya dengan pendedahan yang berterusan kepada tegasan ricih. Kebanyakan kajian telah mempertimbangkan kadar tegasan ricih tunggal dan hanya melakukan eksperimen jangka pendek (1-6 jam), menjadikannya sukar untuk membezakan antara kesan sebenar ricih dan tindak balas tegasan selular terhadap perubahan mendadak dalam persekitaran mikro (Duan et al.2010; Jang et al2013: Maggiorani et al.2015).

Di sini, bioreaktor mikrobendalir digunakan untuk mengkaji kesan tahap tegasan ricih berperingkat ke atasbuah pinggangpengangkut dadah sel tubul proksimal pengangkut kation organik 2(OCT2)dan protein penyemperitan pelbagai ubat dan toksin 1(MATE1). Kami menunjukkan bahawa peningkatan tegasan ricih apikal membawa kepada peningkatan pengangkutan kation organik dan ekspresi pengangkut dan silia terlibat dalam tindak balas selular ini terhadap tegasan ricih.

Bahan dan Kaedah

Pembuatan dan Pemasangan Peranti. Kami sebelum ini telah menerbitkan reka bentuk kami untuk bioreaktor plat selari yang menyediakan laluan aliran bendalir ketinggian boleh laras merentasi bahagian apikal sel dan takungan statik pada bahagian basal (Brakeman et al., 2016). Untuk kerja yang dibentangkan di sini, kami menyesuaikan reka bentuk kami sebelum ini untuk mencipta peranti bermultipleks dengan empat laluan aliran berasingan untuk membolehkan ujian empat keadaan biologi sekali gus (Gamb.1). Setiap peranti terdiri daripada tiga lapisan: tapak dengan takungan apikal 5-ml, plat tengah untuk memegang sisipan Snapwell（Costar, Corning, Corning, NY）dengan luas sel 1.12cm² dan plat atas yang mengandungi takungan basolateral 1-hingga 2-ml. Pinggan-pinggan

telah dimesin daripada polisulfon untuk membolehkan pensterilan dengan autoklaf. Gasket silikon potong laser setinggi 500- hingga 1000-um diapit di antara setiap set plat untuk mengelak petak bendalir dan pada bahagian apikal untuk menentukan ketinggian saluran. Bioreaktor dipasang menggunakan skru. Takungan media dan perangkap gelembung adalah lajur terbina dalam. Salur masuk dan alur keluar disambungkan menggunakan penyambung berduri ke tiub silikon Masterflex LS14 dengan diameter dalam 1.6-mm(Cole Parmer Lab Supplies, Vernon Hills, IL). Aliran bendalir dan dengan itu tegasan ricih apikal telah ditetapkan dan dikawal oleh pam peristaltik (Cole Parmer).

Kultur dan Aliran Sel. Sel MDCK yang ditransfeksi dengan sama ada vektor kosong atau sepasang pengangkut pengambilan dan efluks (hOCT2/hMATE1)(Konig et al..2011) telah disediakan oleh Dr. Martin Fromm (Erlangen, Jerman) dan dikultur dalam medium penting minimum dengan larutan garam seimbang Earle (Kemudahan Kultur Sel UCSF) dengan 10 peratus serum lembu janin (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) dan 1 peratus penisilin-streptomisin (Kemudahan Kultur Sel UCSF). Lima ratus mikrogram setiap mililiter hygromycin (Kemudahan Kultur Sel UCSF) dan 100 mg/j ml geneticin (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO) telah ditambahkan pada media untuk sel transfeksi berganda. Untuk eksperimen aliran, sel hOCT2/hMATE1 MDCK disalut pada bahagian bawah sisipan Snapwell(Corning)pada ketumpatan 300,000 sel/telaga(250,000 sel/cm"), ditanam dalam keadaan statik sehingga pertemuan. dan kemudian diletakkan dalam bioreaktor. Aliran media apikal dinaikkan dalam tempoh 7 hari daripada 0.1 kepada 1-6mlmin sehingga tegasan ricih yang diingini dicapai dan kemudian dibiarkan stabil selama 72 jam sebelum percubaan. Sel telah ditanam dalam keadaan statik untuk jumlah masa yang sama seperti kawalan .

Imunofluoresensi. Sel telah dibetulkan dengan 4 peratus paraformaldehid (Thermo Fisher Scientific), diperbolehkan dengan 0.1 peratus Triton-Xin PBS(Sigma-Aldrich) dan disekat dengan albumin serum lembu (Sigma-Aldrich). Mereka kemudiannya diinkubasi dengan pencairan 1:50 bagi Alexa 488label zonula occludens-1 antibodi monoklonal tetikus (Life Technologies, Carlsbad, CA) atau antibodi monoklonal tikus -tubulin asetilasi primer (Life Technologies) selama 60 minit. Sel-sel yang dirawat dengan antibodi a-tubulin kemudian diinkubasi dengan antibodi 561 anti-tikus kambing sekunder (Life Technologies) dan phalloidin (Thermo Fisher Scientific) untuk pewarnaan F-actin. Pengimejan dilakukan menggunakan mikroskop confocal spektrum Nikon (Tokyo, Jepun) dengan objektif minyak 40x.

Prestasi Penghalang. Inulin, polimer 5000 Da, adalah penanda yang terkenal bagi kadar penapisan glomerular dan merupakan penanda kebocoran tubul proksimal dalam vivo (Sohtell et al, 1983):

Inulin berlabel FITC (Sigma-Aldrich) telah ditambahkan pada media apikal dan dibenarkan mengalir melalui peranti. Sampel dikumpulkan dari takungan basal setiap 24 jam dan dianalisis untuk kandungan inulin menggunakan pembaca plat pendarfluor Genios Pro (Tecan, Mannedorf, Switzerland). Fungsi penghalang monolayer sel dikira daripada paras inulin yang diukur dalam petak apikal dan basal seperti yang diterangkan oleh persamaan 1. Di sini, Modal ialah kepekatan inulin dalam petak apikal, dan C Mal ialah kepekatan dalam petak basal. Inulinleak dikira sebagai kepekatan dalam petak basal (penderma) dibahagikan dengan kawasan sel selepas 24 jam.

ASP ditambah Pengangkutan. Gen pengangkut yang ditransduksi telah diinduksi dengan 10 mM Na-butyrate (Sigma-Aldrich) 24 jam sebelum eksperimen pengangkutan, seperti yang diterangkan sebelum ini (Konig et al, 2011). Apabila sesuai, sel diinkubasi dengan perencat （500μM imipramine atau 1 mM cimetidine(Sigma-Aldrich)) pada bahagian basal selama 30 minit, diikuti dengan penambahan 25μM 4-（4-dimethylamino）- styryl-N-methyl pyridinium (ASP plus )(Life Technologies)dan pengeraman selama 1 jam. Sampel dikumpulkan dari media apikal dan basal. Sel-sel kemudiannya dibilas dengan garam penampan fosfat ais sejuk tiga kali dan dilisiskan untuk pengukuran ASP ditambah pengumpulan dan pengangkutan. Eksperimen pengangkutan dilakukan secara serentak pada sel di bawah tegasan ricih dan dikultur dalam keadaan statik. Kepekatan ASP ditambah telah dikira pada pembaca plat pendarfluor Genios Pro (Tecan) pada panjang gelombang pengujaan 485 nm dan panjang gelombang pelepasan 590 nm.

Kuantifikasi Protein. Sel telah dilisiskan dengan penimbal lisis SDS-10 M NaOH 1 peratus sambil digoncang semalaman. Kandungan protein diukur menggunakan kit ujian protein Pierce BCA standard (Thermo Fisher). Di mana sesuai, kandungan protein telah dinormalkan ke kawasan pertumbuhan sel.

Ungkapan RNA. RNA diekstrak daripada sel menggunakan Kit Pengekstrakan RNA RNeasy (Qiagen, Hilden, Jerman), dan cDNA dijana menggunakan kit skrip (Bio-Rad, Hercules, CA). cDNA digunakan untuk pengesanan manusia dan anjing OCT2 dan MATE1 dan anjing P-glikoprotein (P-GP) melalui tindak balas rantai transkripase-polimerase terbalik kuantitatif menggunakan ujian Tagman dan probe(Applied Biosystems) pada instrumen PCR Masa Nyata Pantas (Applied Biosystems). Protein ribosom S18 (RS-18) telah digunakan sebagai kawalan pengemasan. Kesan tegasan ricih pada ekspresi pengangkut dianalisis menggunakan kaedah 4ACt menggunakan aras pengangkut yang dinyatakan secara relatif kepada RS-18(Peters et al.2007; Schmittgen dan Livak,2008). P-GP digunakan sebagai ukuran kesan global tegasan ricih pada ekspresi pengangkut.

Deciliation. Sel-sel telah ditanam kepada pertemuan dan kemudian diinkubasi tanpa kehadiran atau kehadiran 30 mM ammonium sulfat (Fluka AG) selama 24 jam sebelum pengukuran ASP ditambah pengangkutan (Oxergard et al 2009). Kehadiran silia ditentukan oleh pengimejan a-tubulin seperti yang diterangkan di sini.

Perangkaan. Semua eksperimen telah dilakukan dalam tiga kali ganda dengan sekurang-kurangnya dua replika teknikal dalam setiap percubaan. Data dinyatakan sebagai min ± SD dan digraf sebagai plot kotak dan kumis. Analisis statistik dilakukan dengan analisis varians sehala atau dua hala yang tidak berpasangan, dan nilai P bagi<0.05 was="" considered="" significant.="" data="" were="" analyzed="" using="" prism="" version="" 6.0="" (graphpad,="" san="" diego,="">

Keputusan

Morfologi Sel dan Fungsi Penghalang. Analisis terbaru imunofluo terhadap sel yang diletakkan di bawah aliran mendedahkan pembentukan monolayer seragam dengan protein simpang ketat, zonula occludens-1, disetempatkan kepada simpang ketat antara sel di bawah kedua-dua keadaan statik dan aliran (Rajah 2, A–C). Kuantifikasi jumlah kandungan protein menunjukkan peningkatan sehingga 1.6-kali ganda dalam kandungan protein bagi setiap sentimeter persegi lapisan tunggal sebagai tindak balas kepada tegasan ricih (Gamb. 2D). Seterusnya, kami mengukur kebolehtelapan inulin, penanda kebocoran tubul proksimal, merentasi lapisan tunggal. Peranti mengekalkan kadar prestasi penghalang sebanyak 97.9 peratus 6 1.42 peratus sepanjang 7 hari kultur di bawah sehingga 2 dyne/cm2 tegasan ricih (Rajah 2E), menghasilkan kadar kebocoran inulin akhir pada hari ke-6 { {15}}.13–0.69 mg/cm2 sehari.

Kesan Tegasan Ricih ke atas Pengangkutan Kation Organik. Pengangkutan ASP plus , substrat auto-pendarfluor OCT2 dan MATE1, diukur selama 1 jam pada tahap tegasan ricih（0 yang berbeza.2-2 dynes/cm²）. Sel MDCK yang mengekspresikan hOCT2 dan hMATE1 secara eksogen menunjukkan peningkatan 4.2-kali ganda dalam ASP ditambah pengangkutan sebagai tindak balas kepada tegasan ricih 2 dynes/cm²seperti yang ditunjukkan dalam ukuran pengumpulan selular (Rajah 3A) dan pengangkutan transselular (Rajah. 3B). Kesan tegasan ricih pada pengumpulan ASP tambah atau pengangkutan transselular adalah serupa di bawah tegasan ricih 0.5 dan 2 dina/cm². Untuk menentukan sama ada pengangkutan ASP tambah aktif telah ditingkatkan, trans-port ASP tambah oleh sel yang terdedah kepada 0.2 dyne/cm tegasan ricih diukur dengan atau tanpa prarawatan dengan 500 uM imipramine, OCT{{20} } dan MATE1-perencat khusus. Pengangkutan ASP tambah telah dihalang oleh imipramine 60.3 peratus ± 15.8 peratus di bawah keadaan tegasan ricih berbanding dengan 47.6 peratus ±19.7 peratus dalam keadaan statik (Rajah 3C).

Untuk memahami lebih lanjut pemerhatian ini, kesan tegasan ricih ke atas ekspresi OCT2 manusia (transfected), anjing OCT2 (endogen), dan taring P-GP (endogen) diukur dalam sel yang terdedah kepada pelbagai tahap ricih selama 72 jam selepas peningkatan perlahan ricih selama 7 hari (Rajah 4). Berbanding dengan sel yang dibiakkan dalam keadaan statik, sel MDCK yang terdedah kepada ricih menunjukkan peningkatan ekspresi OCT2 manusia yang ditransfeksi dan endogen (sehingga 3.7- dan 2.0-lipatan, masing-masing), tanpa kesan ketara pada ekspresi MATE1 yang ditransfeksi atau P-GP endogen.

Peranan Silia dalam Tindak Balas Terhadap Ricih. Pengimejan menunjukkan bahawa sel MDCK yang ditransfeksi dua kali mengekspresikan silia di bawah kedua-dua keadaan statik dan aliran (Rajah 5, A dan E). Pendedahan sel kepada 30 mM ammonium sulfat selama 24 jam menyebabkan kehilangan sepenuhnya silia(Gamb.5, C dan G). Yang penting, kemerosotan tidak mempunyai kesan kasar pada persimpangan sel-membran, seperti yang diukur dengan pengimejan F-aktin, yang menambat protein persimpangan ketat pada persimpangan sel-membran dalam sel epitelium (Rajah 5.D dan HD(Stevenson dan Begg. 1994). Walaupun terdapat beberapa penebalan pewarnaan F-aktin dalam imej-imej ini, ini bukanlah penemuan yang konsisten, dan oleh itu kami tidak mengukur kesan ini. Desiliasi tidak mempunyai kesan ke atas pengangkutan oleh sel yang dikultur dalam keadaan statik. tetapi ia sepenuhnya menghapuskan kesan tegasan ricih pada ASP serta pengangkutan dalam sel yang terdedah kepada 0.5 dina/cm² ricih （Rajah 6）.

Perbincangan

Buah pinggang memainkan peranan penting dalam penyingkiran dadah dalam tubuh manusia. Adalah penting untuk meniru dengan tepat kerumitan fisiologi buah pinggang untuk ujian ubat in vitro, terutamanya berkenaan dengan aliran bendalir. Tegasan ricih daripada aliran bendalir telah terbukti mempengaruhi morfologi sel dan pengangkut ion secara in vitro, tetapi sedikit yang diketahui tentang kesan ke atas pengangkut dadah (Duan et al., 2010; Ferrell et al., 2012; Jansen et al., 2016) . Selain itu, kebanyakan kajian terdahulu hanya mengukur kesan ricih jangka pendek (1-6 jam), yang tidak mungkin mengasingkan sepenuhnya kesan tegasan ricih daripada tindak balas tegasan selular yang lain (Duan et al..2010; Jang et al. 2013; Maggiorani et al..2015). Dalam kajian ini, kami menumpukan pada kesan tegasan ricih mampan (7 hari) daripada aliran bendalir ke atas pengangkutan dadah untuk lebih meniru tegasan ricih mampan yang dialami olehbuah pinggangtiubsel dalam vivo.

Memahami cara pengangkut ubat bertindak balas terhadap tegasan ricih yang berterusan boleh meningkatkan ramalan in vitro pengendalian dadah in vivo oleh buah pinggang. Model buah pinggang in vitro yang direka dengan tepat boleh menyeragamkan ujian praklinikal dan mengurangkan kadar kegagalan ubat.

Dalam kerja ini, bioreaktor mikrofluidik plat selari digunakan untuk menentukan kesan tegasan ricih mampan pada pengangkutan kation organik oleh OCT2 dan MATE1 dalambuah pinggangtubultalian sel. Beberapa garisan sel telah dipertimbangkan untuk kajian ini, termasuk garisan sel manusia seperti sel tubul proksimal manusia daripada kumpulan Hopfer(Orosz et al,2004) dan RPTECs(CRL-4031:American Type Culture Collection, Manassas, VA)( Wieser et al., 2008), tetapi sel MDCK hOCT2 / hMATE1 yang ditransfeksi dua kali dianggap sebagai pilihan yang paling sesuai untuk kajian ini atas beberapa sebab. Pertama, sel MDCK secara konsisten menunjukkan lampiran yang teguh pada sisipan transwell, yang membolehkan mereka menahan tekanan awal aliran bendalir. Kedua, sel-sel ini membentuk lapisan tunggal yang ketat, yang menghalang kebocoran dan penting untuk kajian pengangkutan transselular substrat penanda. Akhirnya, ekspresi eksogen pengangkut membolehkan pengesanan pengangkutan aktif yang lebih baik dan kesan gangguan.

Sel-sel yang diletakkan di bawah aliran membentuk monolayer konfluen dan menyetempatkan protein simpang rapat ke pinggir sel. Mereka juga mengekalkan fungsi penghalang yang tinggi seperti yang diukur oleh kebolehtelapan inulin. Keupayaan sel epitelium untuk membentuk lapisan tunggal yang menghalang kebocoran cecair dan protein adalah sangat penting untuk fungsi tubul yang betul. Di sini, kebocoran melalui sel MDCK adalah minimum iaitu kurang daripada 1 ug/cm²sehari dan jauh lebih rendah daripada itu melalui sel manusia. Kami sebelum ini telah menunjukkan bahawa monolayer sel buah pinggang manusia mempunyai kebocoran inulin 10-20 ug/cm²sehari（Brakeman et al.,2016), menyokong kesimpulan bahawa sel MDCK hOCT2/hMATE1 membentuk monolayer yang teguh.

Pengangkutan ASP plus telah meningkat dengan ketara dalam sel hOCT2/hMATE1 MDCK yang terdedah kepada pelbagai tahap tegasan ricih selama 72 jam berbanding dengan kawalan statik. ASP plus diambil oleh OCT2(SLC22A2) dan dibuang oleh MATE1 (SLC47A1), dua pengangkut kation organik yang bekerja secara bersama untuk memudahkanbuah pinggangrembesan ubat yang biasa digunakan, seperti metformin dan cisplatin (Biermann et al.2006; Wittwer et al.2013). Kesan yang sama daripada tegasan ricih telah dilaporkan untuk pengangkut ion tubul proksimal. Peningkatan dalam pengambilan albumin, penyerapan semula ion, dan ekspresi dan fungsi megalin dan tubulin telah dilaporkan sebagai tindak balas kepada peningkatan tegasan ricih (Overgaard et al..2009; Duan et al.2010: Ferrell et al..2012:Raghavan et al., 2014). Dedahan daripadabuah pinggangsel tubul proksimal untuk tegasan ricih juga dikaitkan dengan pengurangan apoptosis dan pemulihan yang lebih cepat daripada ketoksikan cisplatin akut dan perencatan pengangkutan anion organik yang dipertingkatkan (Jang et al.2013). Memandangkan tegasan ricih daripada aliran bendalir sentiasa ada dalam tubul proksimal, penemuan ini secara kolektif menyokong penggunaan lebih banyak sistem model in vitro fisiologi untuk meramalkan pelupusan dan ketoksikan ubat buah pinggang. Perlu diperhatikan bahawa tiada perbezaan yang ketara dalam fungsi pengangkut antara 0.5 dan 2.0 dynes/cm² tegasan ricih. Kajian terdahulu oleh Essig dan Friedlander (2003) telah mendapati bahawa tahap ricih minimum 0.17 dynes/cm2 diperlukan untuk menimbulkan perubahan dalam morfologi sel dan kajian lain telah mengukur kesan ke atas fisiologi sehingga 1 dyne/cm²（Duan et al., 2010）. Ini adalah kajian pertama untuk meneroka kesan julat tahap tegasan ricih yang lebih tinggi dan berkekalan ke atas kefungsian pengangkut ubat buah pinggang, dan ada kemungkinan bahawa magnitud perbezaan biologi antara 0.5 dan 2.0 dina/cm² tegasan ricih yang kita dinilai tidak cukup besar untuk membolehkan mengenal pasti perbezaan antara tahap tegasan ricih ini dalam ujian kami. Walaupun penyiasatan lanjut diperlukan, keputusan kami menjelaskan keadaan yang diperlukan untuk model fisiologi yang berkaitan dan kesan peningkatan tahap tegasan ricih akibat penyakit ini terhadap pengendalian ubat buah pinggang.

Salah satu batasan kaedah eksperimen kami ialah kami hanya menangani pengangkutan pada pH 7.4 menggunakan media dengan pH 7.4 pada kedua-dua sisi apikal dan basal yang meniru kaedah eksperimen yang diterangkan sebelum ini untuk sel MDCK hOCT2/hMATE1 (Konig et al..2011). Kecerunan pH apikal kepada basal boleh menjejaskan fungsi OCT2 dan MATE1, dan biasanya terdapat kecerunan pH di bawah keadaan fisiologi (Muller et al., 2013). Kaedah kami, oleh itu, mengehadkan keupayaan kami untuk menilai interaksi antara kecerunan pH apikal kepada basal dan tegasan ricih pada fungsi OCT2 dan MATE1. Oleh kerana kami menggunakan pHof7.4 yang konsisten dalam semua keadaan eksperimen, kekurangan kecerunan pH ini tidak mungkin menjejaskan penemuan kami tetapi berpotensi mengehadkan kebolehgunaan penemuan kami kepada pengangkutan OCT2 dan MATE1 dengan kehadiran kecerunan pH apikal kepada basal.

Yang menghairankan, ekspresi mRNA bagi OCT2 manusia dan endogen yang ditransfeksi telah meningkat dalam sel yang terdedah kepada semua tahap tegasan ricih berbanding dengan kawalan statik. Penyelarasan ekspresi pengangkut ini adalah khusus, tanpa kesan yang boleh diukur pada ekspresi P-GP endogen atau MATE1 yang ditransfeksi. Penyelarasan ekspresi pengangkut memberi gambaran tentang mekanisme di sebalik peningkatan pengangkutan dan mungkin hasil daripada kestabilan mRNA yang dipertingkatkan atau peningkatan transkripsi mRNA. Adalah menarik untuk diperhatikan bahawa kedua-dua pengangkut yang ditransmisikan dan endogen telah dikawal selia, yang tidak dijangka sejak OCT2 yang ditransmisikan dinyatakan di bawah promoter sitomegalovirus dan tidak sepatutnya tertakluk kepada mekanisme pengawalseliaan ekspresi gen endogen. Walaupun mengejutkan, pemerhatian ini tidak pernah berlaku sebelum ini. Kesan yang sama pada sel tubul proksimal yang ditransfeksi OAT1 yang terdedah kepada perfusi telah dilaporkan, tetapi mekanisme untuk peningkatan ekspresi masih tidak jelas (Jansen et al., 2016). Dalam kajian lain, isyarat Nrf2 didapati memainkan peranan dalam meningkatkan ekspresi MATE2-K endogen sebagai tindak balas kepada tegasan ricih (Fukuda et al., 2017). Kajian lanjut mengenai perkara ini adalah wajar dan akan menjadi subjek penyiasatan masa depan.

Kami juga mengenal pasti bahawa pengenalan aliran ricih apikal meningkatkan kandungan protein setiap sentimeter persegi sel. Kesan ini adalah magnitud yang sama untuk kedua-dua 0.5 dan 2dynes/cm² ricih, serupa dengan kesan yang dilihat untuk ekspresi mRNA dan pengangkutan ASP tambah. Terdapat beberapa bukti bahawa tegasan ricih mendorong lebih tinggibuah pinggangsel epitelium, yang akan menghasilkan jumlah sel yang lebih besar bagi setiap sentimeter persegi dan dengan itu kemungkinan peningkatan dalam protein setiap sentimeter persegi; namun, fenomena yang diterbitkan sebelum ini hanyalah pemerhatian kecil dalam badan data yang lebih besar dan tidak dikuantisasi (Long et al., 2017). Peningkatan jumlah protein dalam sel yang ditanam dengan kehadiran aliran ricih apikal mungkin mewakili kandungan protein biasa untuk sihatbuah pinggangtiubsel epitelium yang boleh dicapai hanya dengan pendedahan sel kepada aliran ricih apikal. Oleh itu, tahap kandungan protein yang lebih rendah dalam sel yang ditanam dalam budaya statik mungkin mewakili keadaan selular yang tidak normal seperti yang boleh berlaku secara klinikal dalam situasi aliran penapisan apikal yang rendah seperti kecederaan buah pinggang akut. Fenomena ini patut dikaji lebih lanjut.

Silia diketahui mempunyai peranan mekanosensori dalam tubul proksimal (Raghavan dan Weisz,2016). Oleh itu, untuk menentukan sama ada ia memainkan peranan penting dalam peningkatan pengangkutan pengantara OCT2 dan MATE1-yang dilaporkan di sini, kesan penyingkiran silia pada fungsi pengangkut telah diukur. Sekatan lengkap peningkatan bergantung ricih dalam ASP ditambah pengangkutan dengan penyingkiran silia dalam kajian kami adalah serupa dengan kesan yang ditemui dalam kajian oleh Raghavan et al. (20}14), yang menunjukkan peningkatan yang bergantung kepada silia dalam endositosis sebagai tindak balas kepada aliran bendalir. Ammonium sulfat mungkin mempunyai kesan lain yang tidak dicirikan pada tingkah laku dan kefungsian sel yang secara tidak langsung boleh memberi kesan kepada pengangkutan bahan terlarut. Walaupun terdapat kemungkinan kesan luar sasaran, kaedah penyahsiliasian ini menguji peranan penderiaan siliari pada pergerakan pengangkut-pengantara bahan larut organik. Mekanisme isyarat antara protein mekano-deria dalam silia dan pengangkut pada masa ini tidak diketahui. Satu hipotesis ialah fungsi pengangkut kation organik diubah oleh pengangkutan ion yang diubah. Penyingkiran silia diketahui mengubah motilitas zat terlarut dalam sel tubul proksimal, khususnya dengan mengurangkan Nat/K plus . Penyetempatan membran ATPase dan mengubahsuai pengangkutan paraselular (Overgaard et al.., 2009). Ada kemungkinan bahawa ini mengakibatkan perubahan dalam fungsi MATE1, antiporter bergantung pada kecerunan H. Hipotesis lain ialah pengesanan tegasan ricih mempengaruhi ekspresi pengangkut kation organik. Tegasan ricih memodulasi fungsi MATE2-K melalui isyarat Nrf2 (Fukuda et al.,2017). Pengangkut kation organik lain mungkin bertindak balas sama terhadap tegasan ricih, yang akan dihapuskan apabila silia mekanosensori dikeluarkan. Kebanyakan perkara ini tidak diketahui dan memerlukan kajian lanjut. Menariknya, penyingkiran silia tidak mempunyai kesan yang ketara ke atas pengangkutan ASP ditambah oleh sel yang terdedah kepada tegasan ricih 0.2 dina/cm², tetapi kesan teguh diperhatikan apabila tegasan ricih dinaikkan kepada 0.5 dina/cm2. Ini menunjukkan bahawa silia merasakan tahap tegasan ricih ambang; seterusnya, isyarat silia perubahan dalam ekspresi dan fungsi pengangkut sebelum kesan yang boleh diukur pada pengangkutan dijangka. Secara keseluruhannya, pergantungan pengangkutan kation organik pada penderiaan ciliary bagi tegasan ricih memberikan gambaran tentang laluan isyarat mekanosensori yang terlibat dan tahap tegasan minimum yang mungkin diperlukan untuk mencetuskan tindak balas yang teguh terhadap ricih.

Ringkasnya, data ini menunjukkan bahawa tegasan ricih daripada aliran bendalir mempunyai kesan yang ketara ke atas fungsi dan ekspresi pengangkut kation organik dalam sel MDCK. Tambahan pula, pengawalseliaan pengangkutan kation organik bergantung kepada kehadiran silia. Kami mencadangkan bahawa tegasan ricih apikal adalah komponen penting dalam mana-mana pemodelan in vitrobuah pinggangtiubsel dan berkemungkinan menjadi komponen penting dalam memodelkan pembersihan rembesan buah pinggang dan nefrotoksisiti ubat. Mekanisme khusus di mana isyarat tekanan mekanikal meningkatkan aktiviti dan ekspresi pengangkut masih tidak jelas dan memerlukan kajian lanjut.

Rujukan

Astashkina A, Mann B, dan Grainger DW (2012) Penilaian kritikal model kultur sel in vitro untuk saringan dan ketoksikan ubat berdaya tinggi. Pharmacol Ther 134:82–106.

Biermann J, Lang D, Gorboulev V, Koepsell H, Sindic A, Schröter R, Zvirbliene A, Pavenstädt H, Schlatter E, dan Ciarimboli G (2006) Pencirian mekanisme pengawalseliaan dan keadaan pengangkut kation organik manusia 2. Am J Physiol Cell Fisiol 290:C1521–C1531.

Brakeman P, Miao S, Cheng J, Lee CZ, Roy S, Fissell WH, dan Ferrell N (2016) Bioreaktor mikrobendalir modular dengan daya pemprosesan yang lebih baik untuk penilaian sel epitelium buah pinggang terpolarisasi. Biomikrobendalir 10:064106.

Duan Y, Weinstein AM, Weinbaum S, dan Wang T (2010) Perubahan yang disebabkan oleh tegasan ricih penyetempatan dan ekspresi pengangkut membran dalam sel tubul proksimal tetikus. Proc Natl Acad Sci USA 107:21860–21865.

Ernandez T, Udwan K, Chassot A, Martin PY, and Feraille E (2018) Union nephrectomy dan tegasan ricih cecair apikal mengurangkan kelimpahan ENaC dalam mengumpul sel utama saluran. Am J Physiol Renal Physiol 314:F763–F772.

Essig M dan Friedlander G (2003) Tegasan ricih tiub dan fenotip sel tiub proksimal buah pinggang. J Am Soc Nephrol 14 (Bekalan 1): S33–S35.

Ferrell N, Desai RR, Fleischman AJ, Roy S, Humes HD, dan Fissell WH (2010) Bioreaktor mikrobendalir dengan elektrod pengukuran rintangan elektrik transepithelial bersepadu (TEER) untuk penilaian sel epitelium buah pinggang. Bioteknol Bioeng 107:707–716.

Ferrell N, Ricci KB, Groszek J, Marmerstein JT, dan Fissell WH (2012) Pengendalian albumin oleh sel epitelium tubular renal dalam bioreaktor mikrobendalir. Bioteknol Bioeng 109:797–803.

Ferrell N, Ricci KB, Desai RR, Groszek J, Marmerstein JT, dan Fissell WH (2012) Bioreaktor mikrobendalir untuk kajian sel epitelium di bawah tegasan ricih cecair. FASEB J 26:911.3.

Fukuda Y, Kaishima M, Ohnishi T, Tohyama K, Chisaki I, Nakayama Y, Ogasawara-Shimizu M, dan Kawamata Y (2017) Tegasan ricih bendalir merangsang ekspresi MATE2-K melalui pengaktifan laluan Nrf2. Biochem Biophys Res Commun 484:358–364.

Giacomini KM, Huang SM, Tweedie DJ, Benet LZ, Brouwer KLR, Chu X, Dahlin A, Evers R, Fischer V, Hillgren KM, et al.; Konsortium Pengangkut Antarabangsa (2010) Pengangkut membran dalam pembangunan dadah. Nat Rev Drug Discov 9: 215–236.

Jang KJ, Mehr AP, Hamilton GA, McPartlin LA, Chung S, Suh KY, dan Ingber DE (2013) Tubul-on-a-cip proksimal buah pinggang manusia untuk pengangkutan dadah dan penilaian nefrotoksisiti. Integr Biol 5:1119–1129.

Jansen J, Fedecostante M, Wilmer MJ, Peters JG, Kreuser UM, van den Broek PH, Mensink RA, Boltje TJ, Stamatialis D, Wetzels JF, et al. (2016) Tubul buah pinggang bioengineered dengan cekap mengeluarkan toksin uremik. Sci Rep 6:26715.

Kola I dan Landis J (2004) Bolehkah industri farmaseutikal mengurangkan kadar pergeseran? Nat Rev Drug Discov 3:711–715.

König J, Zolk O, Singer K, Hoffmann C, dan Fromm MF (2011) Sel MDCK yang ditransfeksi dua kali yang menyatakan OCT1/MATE1 atau OCT2/MATE1 manusia: penentu pengambilan dan translokasi transselular kation organik. Br J Pharmacol 163:546–555.

Long KR, Shipman KE, Rbaibi Y, Menshikova EV, Ritov VB, Eshbach ML, Jiang Y, Jackson EK, Baty CJ, dan Weisz OA (2017) Endositosis apikal tubul proksimal dimodulasi oleh tegasan ricih bendalir melalui laluan bergantung kepada mTOR. Sel Biol Mol 28:2508–2517.

Maggiorani D, Dissard R, Belloy M, Saulnier-Blache JS, Casemayou A, Ducasse L, Grès S, Bellière J, Caubet C, Bascands JL, et al. (2015) Perubahan akibat tekanan ricih bagi organisasi epitelium dalam sel tiub buah pinggang manusia. PLoS One 10:e0131416.

Morrissey KM, Stocker SL, Wittwer MB, Xu L, dan Giacomini KM (2013) Pengangkut buah pinggang dalam pembangunan dadah. Annu Rev Pharmacol Toxicol 53:503–529.

Müller F, König J, Hoier E, Mandery K, dan Fromm MF (2013) Peranan pengangkut kation organik OCT2 dan protein penyemperitan pelbagai ubat dan toksin MATE1 dan MATE2-K untuk pengangkutan dan interaksi ubat lamivudine antivirus. Biochem Pharmacol 86:808–815.

Orosz DE, Woost PG, Kolb RJ, Finesilver MB, Jin W, Frisa PS, Choo CK, Yau CF, Chan KW, Resnick MI, et al. (2004) Potensi pertumbuhan, keabadian, dan pembezaan sel tubul proksimal manusia dewasa normal. In Vitro Cell Dev Biol Anim 40:22–34.

Overgaard CE, Sanzone KM, Spiczka KS, Sheff DR, Sandra A, dan Yeaman C (2009) Deciliation dikaitkan dengan pembentukan semula dramatik persimpangan sel epitelium dan domain permukaan. Sel Biol Mol 20:102–113.

Peters IR, Peeters D, Helps CR, and Day MJ (2007) Pembangunan dan penggunaan pelbagai ujian gen rujukan dalaman (pembantu rumah) untuk normalisasi kajian ekspresi gen anjing yang tepat. Vet Immunol Immunopathol 117:55–66.

Pfaller W dan Gstraunthaler G (1998) Ujian nefrotoksisiti secara in vitro--apa yang kita tahu dan apa yang perlu kita ketahui. Perspektif Kesihatan Persekitaran 106 (Bekalan 2): 559–569.

Raghavan V, Rbaibi Y, Pastor-Soler NM, Carattino MD, dan Weisz OA (2014) Kawalan tekanan ricih yang bergantung kepada endositosis apikal dalam sel tubul proksimal buah pinggang yang dimediasi oleh silia primer. Proc Natl Acad Sci USA 111:8506–8511.

Raghavan V dan Weisz OA (2016) Membezakan peranan mekanosensori dalam mengawal fungsi tubul proksimal. Am J Physiol Renal Physiol 310:F1–F5.

Schmittgen TD dan Livak KJ (2008) Menganalisis data PCR masa nyata dengan kaedah C(T) perbandingan. Nat Protoc 3:1101–1108.

Sohtell M, Karlmark B, dan Ulfendahl H (1983) FITC-inulin sebagai penanda tubul buah pinggang dalam tikus. Acta Physiol Scand 119:313–316.

Stevenson BR dan Begg DA (1994) Kesan bergantung kepada kepekatan cytochalasin D pada simpang ketat dan filamen aktin dalam sel epitelium MDCK. J Sel Sci 107: 367–375.

Venzac B, Madoun R, Benarab T, Monnier S, Cayrac F, Myram S, Leconte L, Amblard F, Viovy JL, Descroix S, et al. (2018) Kejuruteraan tiub kecil dengan perubahan diameter untuk kajian organisasi sel buah pinggang. Biomikrobendalir 12: 024114.

Watkins PB (2011) Sains keselamatan dadah dan kesesakan dalam pembangunan dadah. Clin Pharmacol Ther 89:788–790.

Wieser M, Stadler G, Jennings P, Streubel B, Pfaller W, Ambros P, Riedl C, Katinger H, Grillari J, dan Grillari-Voglauer R (2008) hTERT sahaja mengabadikan sel epitelium tubul proksimal buah pinggang tanpa mengubah ciri fungsinya. Am J Physiol Renal Physiol 295:F1365–F1375.

Wittwer MB, Zur AA, Khuri N, Kido Y, Kosaka A, Zhang X, Morrissey KM, Sali A, Huang Y, dan Giacomini KM (2013) Penemuan perencat penyemperit 1 (MATE1, SLC47A1) yang kuat, terpilih dan penyemperitan toksin melalui pemprofilan ubat preskripsi dan pemodelan pengiraan. J Med Chem 56:781–795.