Nanoribbon Graphene Oxide Antioksidan Sebagai Agen Pemutih Novel Menghalang Mekanisme Melanogenesis

Hubungi:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Hsin-Yu Chou, Hui-Min David Wang,* Chia-Heng Kuo, Pei-Hsuan Lu, Lin Wang, Wenyi Kang dan Chia-Liang Sun*

ABSTRAK:Dalam proses sintesis melanin, tindak balas oksidatif memainkan peranan penting, dan ia adalah strategi yang baik untuk menghalang pengeluaran melanin dengan mengurangkan tekanan oksidatif. Fullerene dan derivatifnya, atau kompleks, dianggap sebagai penghapus radikal bebas yang kuat, dan kami selanjutnya menggunakan nanokarbon sp2 berbilang lapisan untuk menemuimelaninmekanisme perencatan sintesis. Dalam kajian ini, kami menggunakan bahan nano novel, seperti tiub karbon berbilang dinding (MWCNTs), MWCNTs jenis pendek, nanoribbons graphene oxide (GONRs), dan GONRs jenis pendek, sebagai agen anti-oksidatif untuk mengawal pengeluaran melanin. Keputusan menunjukkan bahawa GONR mempunyai keupayaan anti-oksidatif yang lebih baik dalam platform analisis tekanan oksidatif intrasel dan ekstraselular daripada yang lain. Kami mencadangkan bahawa GONR mempunyai kumpulan berfungsi yang mengandungi oksigen. Dalam ujian diacetate 2', 7'-dichlorodihydrofluorescein, kami mendapati GONR boleh mengelat ion logam untuk menghilangkan spesies oksigen reaktif. Dalam pandangan pandangan molekul, kami mendapati bahawa bahan nano ini menurunkan sintesis melanin dengan mengurangkan ekspresi gen berkaitan faktor transkripsi yang berkaitan dengan mikroftalmia, dan terdapat akibat yang sama dalam ekspresi protein. Kesimpulannya, GONR adalah agen berpotensi sebagai antioksida baru dan bahan kosmetologi pemutihan kulit.

Cistanche jugaseorang ejen yang berpotensi sebagai novelantioksidandan memutihkan kulitbahan kosmetologi.

1. PENGENALAN

Kulit ialah organ yang menutupi permukaan luar tubuh manusia. Oleh kerana antara muka bersentuhan dengan alam sekitar, lapisan kulit memainkan peranan penting dalam melindungi tubuh daripada patogen, mengelakkan kehilangan air yang berlebihan, mengawal suhu badan, dan sebagainya. Melanosit tumbuh dalam membran basal epidermis kulit dan menyumbang 5 peratus hingga 10 peratus daripada kandungan selular. Mereka telah dicirikan sebagai "kelenjar" unisel yang mempunyai dendrit dan bercabang nipis, panjang, seperti streamer. Melanosit bergerak melalui sel-sel epidermis di sekitaran terdekatnya, mewujudkan buruj sel epidermis di sekeliling setiap melanosit. Terdapat banyak punca dalaman dan luaran penuaan kulit, dan satu faktor tersebut ialah sinaran ultraungu (UV) daripada cahaya matahari.1 Semasa pendedahan UV, paras spesies oksigen reaktif (ROS) dalam kulit meningkat secara mendadak, yang dikenali sebagai tekanan oksidatif. Beberapa faktor ketoksikan alam sekitar juga meningkatkan tekanan oksidatif pada kulit, seperti racun perosak, karbon tetraklorida, logam berat, amina aromatik, dan bahan zarahan 2.5 (PM2.5).2 Dalam mekanisme biokimia, oksidan intrasel terhasil daripada bukan- sistem enzimatik, mengubahnya menjadi ROS untuk mencetuskan laluan melanogenesis.3

Selain ROS, terdapat banyak faktor yang mempengaruhipenghasilan melanin, termasuk ekspresi gen, keradangan, perubahan endokrin, dan pengambilan pigmen.1 Dalam langkah pertama penghasilan melanin, tyrosinase memainkan peranan dalam memangkinkan tirosin kepada fenomelanin dan eumelanin. Kedua-dua mekanisme pembuatan pigmen adalah serupa, termasuk L- tyrosine hydroxylation to 3,4-dihydroxy-L-phenylalanine (L- DOPA) dan L-DOPA oxidation to dopaquinone. Dalam langkah seterusnya, dopamin dioksidakan oleh protein berkaitan tyrosinase 1 (TRP-1) dan protein berkaitan tyrosinase 2 (TRP-2) dalam melanosom, yang dikawal oleh faktor transkripsi berkaitan mikroftalmia ( MITF) untuk membentuk melanin. Akhirnya, melanin matang dan memendakan dalam stratum korneum.4,5 Ini menembusi keratinosit jiran lapisan basal dan melindungi DNA mereka daripada sebarang mutasi atau pengubahsuaian akibat UV. Melanin matang dalam melanosom dipindahkan ke keratinosit6−9 dan akhirnya membawa kepada pigmentasi yang tahan lama. Lentigin, jeragat, dan bintik coklat/hitam kadangkala menyebabkan masalah sosial pada lelaki dan wanita. Menyekat tekanan oksidatif atau menyekat aktiviti tyrosinase adalah satu strategi untuk mengecilkan sindrom hiperpigmentasi dan gangguan dermatologi. Antioksidan menyembuhkan hiperpigmentasi dan kerosakan selular yang disebabkan oleh ROS.10,11 Oleh itu, sebatian anti-oksidatif tersintesis mempunyai banyak aplikasi biofungsi dalam aplikasi penjagaan kulit.

Fullerene (C60), carbon nanotube (CNT), graphene, dan graphene nanoribbon (GNR) ialah empat jenis nanokarbon sp2 yang dikaji secara meluas di seluruh dunia.12 Fullerene dan derivatif atau kompleksnya telah dianggap kuat.pemusnah radikal bebasuntuk masa yang lama. Yodh et al. menggunakan C60 larut air sebagai agen pelindung terhadap degenerasi akibat tekanan katabolik. Suntikan et al. membuat kesimpulan bahawa C60(OH)24 adalah sebatian antioksidan yang kuat apabila tegasan oksidatif terlalu tinggi. Okuda et al. mencadangkan bahawa kompleks C60 boleh menghalang kecederaan sel pengantara NO.13,14 Tong et al. menunjukkan bahawa C60complexes mungkin menjadi calon yang menjanjikan untuk merawat penyakit berkaitan otak yang disebabkan oleh peningkatan paras superoksida. Sebenarnya, sebuah syarikat Jepun mengenal pasti fullerene dengan aktiviti antioksidan yang kuat untuk kegunaan kosmetik pada tahun 2006. Lucente- Schultz et al. menunjukkan bahawa keupayaan penghapusan radikal oksigen bagi CNT berdinding tunggal (SWCNT) yang difungsikan adalah hampir 40 kali ganda lebih besar daripada dendritik C60.15-19 Fenoglio et al. diperhatikan bahawa CNT bertembok berbilang (MWCNTs) mempunyai kapasiti penghapusan radikal yang luar biasa dalam hubungan dengan sumber luaran radikal hidroksil atau superoksida.20 Pengiraan teori fungsi ketumpatan juga mendedahkan model SWCNT sebagai penghapus radikal bebas. Pada tahun 2004, Novoselov et al. pertama kali menunjukkan bahawa graphene mempamerkan kesan elektrik ambipolar yang kuat dan boleh menjanjikan untuk aplikasi elektronik.21 Selepas itu, mereka terus menunjukkan bahawa graphene mempunyai sifat elektronik yang tersendiri untuk gas 2D zarah yang diterangkan oleh persamaan Dirac.22,23 Sejak kedua-dua kertas pecah tanah ini, semakin banyak perhatian telah diberikan kepada penyelidikan berasaskan graphene.24−30 Contohnya, Qiu et al. pada tahun 2014 menunjukkan bahawa graphene oxide dan few-layer graphene mempamerkan aktiviti antioksidan yang ketara dan boleh melindungi pelbagai molekul biomolekul daripada pengoksidaan.31 Han et al. eksperimen menunjukkan pada tahun 2007 bahawa jurang tenaga GNR boleh dikawal semasa proses litografi dengan menukar lebar reben.32 Antara empat nanokarbon, GNR telah mendapat perhatian paling sedikit. Untuk pengetahuan kami, terdapat sedikit kajian tentang sifat antioksidan graphene oxide nanoribbons (GONRs).31,33 Oleh itu, dalam kajian ini, kami menyediakan MWCNTs, MWCNTs pendek, GONRs, dan GONRs pendek dengan teliti dan bertujuan untuk membandingkan sifat antioksidan mereka dan keputusan berkaitan secara sistematik.

2. KEPUTUSAN DAN PERBINCANGAN

2.1. Morfologi MWCNTs dan GONRs.

Figure 1a shows the low- and high-magnification transmission electron microscopy (TEM) images of MWCNTs and short MWCNTs. Following acidic cutting under ultrasonication, the length of MWCNTs could be shortened from >10 μm hingga 2−3 μm. Pada masa yang sama, diperhatikan bahawa rawatan asid nitrik menyebabkan permukaan tiub licin menjadi kasar. Beberapa takuk dan bentuk tidak sekata dipaparkan dalam gambar pembesaran tinggi. Selanjutnya, menggunakan MWCNT dan MWCNT pendek melalui tindak balas gelombang mikro memperoleh GONR dan GONR pendek, masing-masing. Kami juga menggambarkan gambar TEM pembesaran rendah dan tinggi GONR dan GONR pendek. Disebabkan oleh pembukaan membujur utama dan pemotongan mendatar kecil, nampaknya GONR adalah lebih pendek daripada MWCNT. Sebaliknya, gambar pembesaran tinggi menunjukkan diameter yang lebih besar, iaitu, 0.11−0.18 μm, GONR berbanding MWCNT, menunjukkan bahawa proses nyahzip berjaya. Begitu juga, GONR pendek mempamerkan panjang yang lebih pendek dan diameter lebih besar daripada MWCNT pendek. Dalam pemampat udara proses unzip baharu kami, struktur lapisan nipis GONR adalah kurang daripada apa yang kami perolehi dalam laporan awal untuk kuasa gelombang mikro yang sama iaitu 250 W sambil mengekalkan MWCNT pusat yang lebih tebal.12 Ini bermakna MWCNT kulit teras. /GONR heterostructure lebih berkemungkinan muncul dan bukannya struktur nanoribbon yang dibuka sepenuhnya melalui semua kuasa gelombang mikro dalam proses baharu. Untuk membandingkan dengan GONR pendek dalam kajian terdahulu kami,34 kuasa gelombang mikro yang lebih tinggi menghasilkan lebih banyak takuk pada sisi reben dan tidak membentuk tepi reben yang bagus dan licin. Ambil perhatian bahawa kami menggunakan dua jenis grid Cu yang berbeza dalam Rajah 1a. Untuk MWCNT dan GONR dengan panjang yang mencukupi, grid Gu dengan formvar lacey yang distabilkan dengan karbon (no. produk 01881-F, Ted Pella, Inc., USA) telah digunakan. Lubang terbuka dalam filem karbon berenda menghalang imej penghantaran bertindih antara nanokarbon dan filem karbon. Rangkaian kelabu gelap tergolong dalam filem karbon berenda. Walau bagaimanapun, grid Gu dengan formvar distabilkan dengan karbon (nombor produk 01800-F, Ted Pella, Inc., USA) diperlukan untuk MWCNT pendek dan GONR pendek. Ini kerana lubang besar dalam filem karbon berenda menyebabkan masalah untuk memegang MWCNT pendek dan GONR pendek dengan cekap. Seperti yang digambarkan dalam Rajah 1, kontras kelabu muda di bawah MWCNT pendek dan GONR pendek ialah lapisan karbon ringan. Lapisan karbon ini menstabilkan filem formvar yang terdedah kepada pancaran elektron melalui sifat pengalir haba dan elektriknya.

2.2. Konfigurasi Ikatan MWCNT dan GONR.

Spektrum Raman bagi empat nanokarbon dibentangkan dalam Rajah 1b; jalur D GONR adalah lebih tinggi daripada MWCNT selepas proses unzip. Ini disebabkan oleh tahap pengoksidaan yang lebih tinggi dan bilangan struktur tepi GONR yang lebih tinggi berbanding dengan MWCNT. Fenomena ini juga serupa dengan apa yang kita perhatikan dalam 2011.12 Disebabkan oleh tahap grafitasi yang tinggi, jalur G MWCNT mempunyai lebar penuh pada separuh maksimum nombor terendah. Nisbah ID/IG bagi empat nanokarbon ialah {{10}}.076, 0.502, 0.483 dan 0.700, masing-masing. Secara ringkas, pengurangan panjang dan pengoksidaan permukaan meningkatkan tahap kecacatan dan dengan itu menjadikan nisbah ID/IG lebih tinggi. Puncak D' terdapat dalam semua graphene yang rosak dan dilihat sebagai ukuran kualiti.35 Seperti yang digambarkan dalam Rajah 1b, puncak D' dalam empat spektrum menjadi lebih menonjol selepas sama ada proses pemotongan atau unzip, menunjukkan bahawa ia merosakkan. proses yang menimbulkan banyak kecacatan. Rajah 1c,d memaparkan spektroskopi fotoelektron sinar-X bagi empat nanokarbon. Nampaknya, puncak D' adalah yang paling jelas untuk GONR pendek. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1c, paras O meningkat dengan ketara daripada 7.6 peratus (MWCNTs) kepada 19.9 peratus (GONRs) disebabkan oleh keupayaan pengoksidaan kuat KMnO4 dalam persekitaran berasid. Sebaliknya, tahap O meningkat sedikit sebanyak 0.8 peratus daripada MWCNT kepada MWCNT pendek. Yang penting, tahap O tertinggi ialah 38.3 peratus untuk GONR pendek, membayangkan bahawa hujung reben nano akan lebih mudah untuk melampirkan kumpulan berfungsi oksigen daripada permukaan sp2 planar. Nombor maksimum lebar penuh-pada-separuh-maksimum yang lebih besar dan peralihan kepada tenaga pengikat tinggi C 1s memuncak selepas proses unzip kedua-dua MWCNT dan MWCNT pendek digambarkan dalam Rajah 1d. Untuk graphene oxides, puncak terdeconvoluted di bahagian high-binding-energy boleh diberikan kepada C−C(CC), C−O, CO, dan ikatan COOH.36 Kami mencirikan GONR (200 W) pada tahun 2013 ,37 dan keputusannya adalah serupa dengan keputusan kajian ini. Kajian ini menyimpulkan fenomena spektrum Raman, bermakna lebih banyak kumpulan berfungsi yang mengandungi oksigen dijana semasa transformasi tiub ke reben (Rajah 2).

2.3. Sifat Anti-oksidatif MWCNTs dan GONRs.

2.3.1. Penentuan 1,1-Diphenyl-2-picrylhy-drazyl Ujian Aktiviti Penghapusan Radikal Bebas.

1,1- Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) aktiviti penghapusan radikal bebas ialah platform antioksidan yang digunakan untuk mengesan kapasiti anti-oksidatif; keputusan untuk empat nanokarbon diterangkan dalam Jadual 2. Dalam ujian DPPH, vitamin C pada kepekatan 100 μM telah digunakan sebagai kawalan positif. Untuk menguji aktiviti anti-oksidatif MWCNT, MWCNT pendek, GONR dan GONR pendek, dos 1, 5, dan 10 mg/L telah diinkubasi ke dalam larutan tindak balas untuk mengukur sifat. MWCNT, MWCNT pendek, GONR dan GONR pendek mempunyai kebolehan menghalang sederhana pada 10 mg/L (19.2 ± 0.3, 12.1 ± 0.3, 26.8 ± 0.3, dan 30.0 ± 0.4 peratus ), manakala vitamin C mempunyai keadaan yang sama pada 100 μM (93.4 ± 0.1 peratus ) untuk penindasan.

2.3.2. Ujian Aktiviti Ion-Chelating.

Dalam keadaan tegasan oksidatif, ferrozine boleh membina kompleks dengan Fe2 plus untuk diukur secara kuantitatif. Dengan kehadiran mediator pengkelat, kompleks itu rosak, menyebabkan ion ferus berkurangan daripada warna merah gelap kompleks Fe2 plus. Kami menggunakan EDTA sebagai kawalan positif. Jadual 2 menunjukkan bahawa MWCNT, MWCNT pendek, GONR dan GONR pendek mempunyai aktiviti kelat pada 10 mg/L (29.2 ± {{10}}.8, 28.7 ± 0 .7, 69.7 ± 0.6, dan 68.9 ± 0.3 peratus ), manakala kawalan positif mempunyai keadaan yang sama pada 100 μM (93.4 ± 0.1 peratus ).

2.3.3. Pengukuran Kuasa Antioksidan Pengurang Ferrik.

Ujian potensi pengurangan ferik ialah ujian mudah dan boleh dipercayai yang digunakan untuk mengukur sintesis kompleks Fe(III)−ferricyanide. Dalam ujian ini, kuasa pengurangan empat nanokarbon yang menghasilkan kompleks ferus Fe(III)−TPTZ telah dikesan oleh perubahan dalam warna larutan daripada kuning kepada hijau dan biru. Jadual 2 menunjukkan bahawa kuasa pengurangan MWCNT, MWCNT pendek, GONR, dan GONR pendek adalah ketumpatan optik (OD) 1.11, 1.13, 1.15, dan 1.11 pada 10 mg/L.

2.3.4. MWCNTs dan GONRs Menghalang Pengumpulan ROS Intraselular.

Banyak laporan telah menunjukkan bahawa ROS memusnahkan integriti struktur membran sel, termasuk membran sel dan membran nuklear untuk membawa kepada kerosakan sel dan kehilangan fungsi normal.38−40 Selain itu, ROS juga merupakan salah satu faktor penting untuk memangkinkan pembentukan tyrosinase. melanin, dan perencatan pengeluaran ROS adalah strategi yang baik untuk mengecilkan sintesis melanin. Dalam kajian ini, kami menggunakan ujian pewarnaan 2', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFDA) untuk menganalisis tahap tekanan oksidatif intraselular dalam sel rawatan MWCNT dan GONR. Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) mendorong rangsangan oksidatif dalam kumpulan MWCNT dan GONR dan digunakan sebagai kawalan negatif.41 Apabila kepekatan PMA ialah 20 ng/mL, ia menyebabkan tekanan oksidatif, meningkatkan nilai kepada 38 peratus; selepas merawat GONR dan MWCNTs, tahap ROS telah diturunkan ke tahap normal. Data menunjukkan bahawa kedua-dua bahan menghalang tahap tekanan oksidatif, dan kesan anti-oksidatif GONR adalah lebih tinggi daripada MWCNTs (Rajah 3). Jadual 1 menunjukkan senarai akibat yang serupa. Kami menegaskan bahawa terdapat tiga sebab untuk penemuan baharu kami: pertama, susunan keterlarutan bahan ini adalah seperti berikut: GONR pendek > GONR > MWCNT pendek > MWCNT, bermakna kawasan sentuhan GONR pendek adalah yang terbesar, jadi ia adalah unggul untuk ROS scavenging. Kedua, GONR dan MWCNT ialah struktur karbon sp2-yang boleh memusnahkan elektrik ROS melalui pembentukan tambah atau pemindahan elektron.42 Kami mendapati bahawa kesan antioksidan struktur nanoribbon adalah lebih baik daripada struktur nanotiub, jadi nanoribbon menjadikannya lebih mudah untuk memindahkan elektron daripada tiub nano. Akhir sekali, dalam Rajah 1b, kami melihat bahawa tapak karbon GONR sp2-mengandungi lebih banyak kumpulan berfungsi oksigen daripada MWCNT, kumpulan asid karboksilik boleh mengelat ion logam dan kumpulan hidroksil boleh menjadi penderma-H untuk menghilangkan ROS dan menghalang pengeluaran melanin.

2.4. Sitotoksisiti MWCNT dan GONR yang Dirawat dalam Sel Fibroblast Dermal Manusia.

Kaedah {{0}}(4,5-Dimethylth-iazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) telah digunakan untuk menilai sifat sitotoksik GONR pada sel Hs68 (Rajah 3), dan sel telah dibiakkan pada dos berbeza 1, 5, dan 10 ug/mL. Kami memeriksa bahawa daya maju sel MWCNT ialah 100.7 ± 3.7, 99.8 ± 4.9, dan 94.1 ± 4.7 peratus pada kepekatan 1, 5, dan 10 mg/L, masing-masing; daya maju untuk MWCNT pendek dikira dalam susunan yang sama dan didapati 93.9 ± 2.2, 86.4 ± 3.0 dan 98.9 ± 2.1 peratus . Kami memerhatikan bahawa sel B16−F10 telah diinkubasi dalam kepekatan tinggi, dan kemandirian sel sel Hs68 adalah lebih daripada 80 peratus , menunjukkan bahawa MWCNT dan MWCNT pendek tidak mempunyai kesan toksik pada sel fibroblas kulit manusia. Daya maju sel GONR dan GONR pendek ialah 86.24 ± 2.1, 90.87 ± 3.5, 88.58 ± 2.5, 89.03 ± 3.6, 90.71 ± 2.8 dan 90.64 ± 2.5 peratus . Ia juga ditunjukkan dalam Rajah 4a bahawa GONR dan GONR pendek tidak mempunyai kesan sitotoksik yang boleh dilihat pada sel HS68. Dalam laporan sebelum ini, penggunaan bahan nano yang belum diuji untuk tujuan kosmetik boleh dianggap boleh dipersoalkan, 43,44 dan ia biasanya disebabkan oleh serangan DNA selepas nanopartikel memasuki sel. Selepas ujian sitotoksisiti, kami mendapati bahawa bahan kami tidak menyebabkan ketoksikan kepada sel kulit normal. Kami membuat kesimpulan bahawa selepas bahan nano memasuki sel, bahan nano hanya menghalang pengeluaran melanin dengan mengurangkan tekanan oksidatif dan ion logam pengkelat dan tidak merosakkan mitokondria atau DNA, yang bermaksud bahawa MWCNT dan GONR selamat digunakan.

2.5. Dua Jenis MWCNT dan GONR dalam Aktiviti Tirosinase Selular B16−F10 dan Kandungan Melanin.

Dalam laluan sintesis melanin, tyrosinase memainkan peranan penting. Tyrosinase mengoksida dan membentuk eumelanin dan pheomelanin melalui satu siri tindak balas biokimia. Untuk menentukan sama ada GONRs dan MWCNTs menghalang aktiviti tyrosinase dan menyebabkan penurunan dalam pengeluaran melanin, kami menganalisis aktiviti tyrosinase dalam sel B16-F10. Kami mendapati bahawa MWCNT dan MWCNT pendek menghalang aktiviti tyrosinase sebanyak kira-kira 17.1 peratus dan 23 peratus pada 10 mg/L. GONR dan GONR pendek mempunyai kesan yang lebih baik dalam menekan aktiviti tyrosinase pada kepekatan yang sama berbanding dengan GONR yang lain. Mereka juga dalam cara yang bergantung kepada dos dan menghalang 49.8 peratus dan 44.7 peratus daripada aktiviti tyrosinase, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 4b.

Melanin adalah pigmen yang sangat diperlukan dalam tubuh manusia, tetapi ekspresi berlebihan melanin sering mencetuskan beberapa siri penyakit. Dalam kajian terdahulu, Xiao et al. menggunakan bahan yang serupa, Radical Sponge, nanopartikel fullerene, sebagai agen anti-melanin.45 Terdapat beberapa keputusan yang baik; kira-kira 2{11}} peratus pengeluaran melanin boleh dihalang. Untuk meningkatkan kecekapannya, kami menambah baik bahan ujian untuk mengukur kadar perencatan melanin dan mekanisme molekulnya, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 4c dan 5. MWCNT dan MWCNT pendek mengurangkan kandungan melanin sebanyak 17.6 ± 5.5 dan 13.2 ± {{ 16}}.2 peratus pada 10 mg/L dan dalam cara yang bergantung kepada dos. GONR dan GONR pendek dengan kuat menurunkan nilai kepada 32.0 ± 2.3 dan 35.3 ± 3.4 peratus pada 10 mg/L. Keputusan eksperimen mencadangkan bahawa keempat-empat jenis boleh menghalang sintesis melanin dan GONR mempunyai kesan yang lebih kuat. Sebaliknya, kami juga telah melihat bahawa GONR pendek mempunyai kesan yang lebih baik dalam menghalang pengeluaran melanin. Kami menyimpulkan bahawa GONR pendek mempunyai lebih banyak kumpulan berfungsi dan berkesan boleh menghalang tirosinase yang dimangkinkan ion logam, seterusnya menghalang pengeluaran melanin (Rajah 2). Dalam Jadual 1, kita perhatikan bahawa usaha jenis pendek pengkelat ion logam adalah lebih tinggi daripada jenis biasa; ini bermakna bahawa GONR pendek ini berpotensi digunakan dalam bidang kosmetik sebagai agen penjagaan kulit.

2.6. Mekanisme MWCNT dan GONR Menghalang Kandungan Melanin Sel B16−F10.

Sel bertindak balas kepada tekanan oksidatif luaran dengan mengawal ekspresi protein. Sel B16−F10 meningkatkan ekspresi gen c-myc dan AMPK terkawal untuk mengurangkan tahap oksidatif,46 dan dalam kerja ini, MITF ialah faktor transkripsi khusus tyrosinase untuk mengawal selia laluan isyarat sintesis melanin molekul.47−49 Dalam Rajah 5a, MWCNTs dan GONRs mengecilkan faktor transkripsi yang berkaitan dengan mikroftalmia dengan mengurangkan tekanan oksidatif, dan kemudian, gen hiliran TRP-1 dan TRP-2 turut dikurangkan. Untuk tahap protein, fenomena yang sama ditemui, di mana MWCNTs dan GONRs menurunkan laluan melanogenesis berkaitan MITF dan kemudian akhirnya mengurangkan kandungan melanin (Rajah 5b).

3. BAHAN DAN KAEDAH EKSPERIMEN

3.1. Penyediaan MWCNT dan GONR.

Proses yang berkaitan untuk membuat GONR telah dilaporkan dalam kertas sebelumnya.12 MWCNT (0.05 g) telah digantung dalam 9:1 H2SO4/H3PO4 dan dirawat dengan reaktor gelombang mikro (CEM-Discover) dengan kuasa ditetapkan pada 250 W selama 2 min. Selepas penambahan KMnO4(0.25 g) kepada larutan, larutan telah dirawat dengan kuasa gelombang mikro yang sama pada 65 darjah selama 4 min12 Kami kemudiannya mengubahsuai proses ini menggunakan masa gelombang mikro peringkat kedua yang lebih pendek iaitu 8 minit dengan menggunakan pemampat udara. Di sini, pemampat udara digunakan untuk mengawal suhu reaktor gelombang mikro semasa proses. Kuasa gelombang mikro ditetapkan pada 250 W dalam ujian awal.

3.2. Penyediaan MWCNT Pendek dan GONR Pendek.

Proses yang berkaitan untuk membuat GONR pendek telah dilaporkan dalam kertas kerja kami sebelum ini.34 Masa rawatan berasid dipilih sebagai 8 jam. Kuasa gelombang mikro ditetapkan pada 250 W, yang sama seperti untuk mendapatkan GONR.

3.3. Aktiviti Pemusnahan Radikal DPPH.

DPPH kerap digunakan untuk menentukan kapasiti penghapusan sampel dan sifat antioksida.50 DPPH ialah reagen ungu yang menukar warna daripada ungu kepada kuning jika radikal bebas dipindahkan ke analit. Sampel anti-oksidatif positif dengan kepekatan yang sesuai telah ditambah kepada larutan, dan sampel dianalisis pada 517 nm selama 30 minit. Kami menggunakan peratusan baki DPPH selain sampel ujian untuk mengukur jumlah antioksidan yang diperlukan untuk mengurangkan radikal DPPH sebelumnya. Vitamin C pada 100 μM digunakan sebagai kawalan positif. Aktiviti mengais ( peratus ) diukur sebagai

Kapasiti mengais ( peratus )=(Sampel − Kosong) / (Acontrol − Kosong) × 100 peratus (1)

3.4. Aktiviti Kelat Logam.

Ion logam ialah faktor yang menyebabkan pengoksidaan berlebihan lipid, dan Fe2 plus ialah salah satu ion yang paling mempengaruhi.50 Kepekatan nanobiomaterial (1 μL) yang berbeza telah dimuatkan ke dalam plat telaga 96-, yang mengandungi 2 mM FeCl2·4H2O (10 μL), dan kemudian dimuatkan ke dalam ferrozine (5 mM, 20 μL). Bahan tambahan telah diadun sepenuhnya dengan 69 μL mentol dan disimpan pada suhu bilik selama 10 minit. Kemudian, larutan tindak balas sampel diperhatikan pada 562 nm. EDTA digunakan sebagai kawalan positif pada 100 μM, dan formula pengiraan aktiviti pengkelat logam adalah berdasarkan persamaan 1.

3.5. Mengurangkan Kuasa.

Pengiraan kuasa mengurangkan adalah berdasarkan kajian lepas.50 Pertama, 2.5 μL bahan graphene dicampur dengan penimbal PBS (67 mM, pH 6.8) dan K3Fe(CN)6 (2.5 μL, 20 peratus ) dan kemudian diinkubasi pada 50 darjah selama 20 min. Kemudian, 10 peratus asid trichloro asetik (160 μL) dicampur dengan reagen pada 300g disentrifugasi selama 20 minit. Panjang penyerapan ditentukan pada 700 nm selepas dicampur dengan 25 μL FeCl3 (2 peratus). Butylated hydroxyanisole (BHA) digunakan pada 100 μM.

3.6. Pemeriksaan Pembiakan Sel.

Talian sel fibroblas dermal manusia HS68 digunakan untuk menganalisis nisbah percambahan sel. HS68 telah diinkubasi dalam medium Eagle diubah suai (DMEM) Dulbecco yang mengandungi 10 peratus serum lembu janin dan 1 peratus campuran penisilin dan streptomisin.50,51 Selepas dirawat dengan kepekatan sampel yang berbeza, kami menggunakan MTT untuk mengesan nisbah percambahan sel. 8000 sel telah disemai dalam 96-plat perigi dan dirawat dengan sampel selama 24 jam. Larutan supernatan telah dikeluarkan, dan kami menggunakan larutan MTT untuk kultur selama 2 jam pada 37 darjah . Selepas pengeraman, kami mengeluarkan media yang mengandungi MTT dan melarutkannya dengan dimetil sulfoksida (DMSO). Penyelesaian dibaca pada OD 590 nm dan kadar dikira oleh persamaan 1.

3.7. Penilaian Kandungan Melanin Selular.

Kami menggunakan kaedah dengan pengubahsuaian kecil berdasarkan ujian sebelumnya.52,53 Pelet sel B16−F10 daripada Pusat Pengumpulan dan Penyelidikan Sumber Bio (BCRC, CRL 6323, Hsinchu, Taiwan) telah dilarutkan dalam campuran 2.0 N NaOH dan 10 peratus DMSO. Sampel kemudiannya dipanaskan selama 1 jam pada 90 darjah dan disentrifugasi pada 10,000g selama 10 minit lagi untuk mendapatkan supernatan yang dijelaskan. Kiraan melanin ditentukan dengan memantau OD supernatan pada 475 nm.

3.8. B16−F10 Aktiviti Tirosinase Selular.

Untuk aktiviti tyrosinase selular B16−F10, kami merujuk kepada kerja sebelumnya dengan beberapa pengubahsuaian.50 Sel telah dikultur dalam 12-plat perigi pada 105 sel setiap telaga. Selepas rawatan dengan sampel, sel telah dilisiskan dalam 1 peratus Triton X-100/PBS dan 2 mM L-tirosin (50 μL) selama 3 jam. Selepas pengeraman, kami mengeluarkan media dan membaca penyerapan pada OD 590 nm. Formula aktiviti tyrosinase telah dikira dengan persamaan 1.

Cistanche adalah perencat tyrosinase.

3.9. Pengesanan ROS oleh Pewarnaan DCFDA.

Merujuk kepada kajian lepas,54 1.2 1.105 sel B16−F10 telah disemai dalam 6-plat perigi dan dirawat dengan pelbagai kepekatan sampel. Sel telah digantung dalam PBS dan kemudian dimuatkan dengan DCFDA (5 μM) dalam DMEM merah bukan fenol selama 30 minit pada 37 darjah . Sitometer aliran (Guava, Merck, Jerman) digunakan untuk mengesan isyarat pendarfluor DCFDA. Pengujaan dan panjang gelombang pelepasan DCFDA masing-masing adalah 488 dan 535 nm.

3.10. Tindak balas Rantaian Polimerase Masa Nyata Kuantitatif.

Kami mengikuti kaedah Lin et al. (2018).1 Tindak balas rantai transkripsi-polimerase terbalik kuantitatif masa nyata (qRT-PCR) terdiri daripada probe primer eksklusif untuk menjana pendarfluor. Ia menggunakan teknik pengesanan pendarfluor yang mengesan setiap kitaran menggunakan Sistem 7500 qRT-PCR (Applied Biosystems, USA). Ia mengesan kitaran berdasarkan jumlah pendarfluor yang dikeluarkan, dan kemudian produk bagi setiap kitaran dikira untuk kandungan yang dijana, yang menghasilkan mencapai tujuan kuantitatif masa nyata. Trizol (Invitrogen, USA) digunakan untuk mengekstrak RNA lengkap tisu paru-paru, mengikut arahan yang diberikan oleh pengilang. Selepas itu, kit transkripsi terbalik (Takara, Jepun) digunakan untuk menjana DNA. Dalam qRT-PCR menggunakan primer, disenaraikan dalam Jadual 1, pertama, sampel dipanaskan untuk membentuk satu helai DNA; maka pengikatan primer berlaku untuk membentuk DNA beruntai dua (dsDNA), selepas itu dsDNA Hijau SYBR digabungkan, yang mana kit reagen tambah hijau SYBR (Roche, Basel, Swiss) telah digunakan, yang mengakibatkan pelepasan pendarfluor. Hasilnya telah diluluskan melalui sistem pengesanan pendarfluor. Pengesanan isyarat pendarfluor berlaku semasa fasa pemanjangan atau penyepuhlindapan setiap kitaran; selepas pengesanan, kandungan sampel ditolak ke belakang oleh keamatan pendarfluor yang dikesan.55 Tahap ekspresi gen sasaran dinormalkan kepada tahap -tubulin menggunakan kaedah 2−ΔΔCt.

miricetin

3.11. Ujian Western Blot.

Sel B16−F10 dilisiskan pada 4 darjah semalaman dengan penimbal ujian radioimmunoprecipitation (Thermo Scientific Co., USA), yang mengandungi perencat protease. Kit ujian protein asid bicinchoninic (BCA, Sigma-Aldrich Corp., USA) telah digunakan untuk mengukur jumlah protein. Protein sampel diasingkan pada 10 peratus gel natrium dodesil sulfat-poliakrilamida dan dipindahkan ke membran polivinilidena difluorida (PVDF) (PALL Life Science, Ann Arbor, MI, Amerika Syarikat). Membran PVDF telah disekat dengan penimbal penyekat (Thermo Scientific) selama 1 jam dan diinkubasi dengan antibodi primer khusus semalaman pada 4 darjah . Seterusnya, membran dibasuh dengan Tris buffered saline- Tween 20 buffer dua kali dan diinkubasi dengan antibodi sekunder selama 1.5 jam. Selepas itu, membran itu dicelup ke dalam reagen pengesan chemiluminescence (Thermo Scientific) dan dianalisis oleh pengimej MiniChemi Chemiluminescence (Sains Penciptaan Sage Beijing, China). Sumber antibodi termasuk arnab anti-MITF, arnab anti-TRP-1, arnab anti-TRP-2 dan -actin (Thermo Scientific).

3.12. Analisis Bahan.

TEM (JEOL JEM-1230, 100 kV) telah digunakan untuk memerhati morfologi nanokarbon. Spektrometer Raman mikro (PTT, RAMaker) telah digunakan untuk memeriksa mod resonans nanokarbon. Pengukuran spektroskopi fotoelektron sinar-X (XPS, Kratos Axis Ultra DLD) juga dijalankan untuk menentukan analisis komposisi.12,34

3.13. Analisis statistik.

Semua sampel dan eksperimen standard diulang sekurang-kurangnya tiga kali. Kami menggunakan ujian-t Pelajar untuk membandingkan dan menyatakan purata nilai min ± sisihan piawai secara statistik.

4. KESIMPULAN

Sebagai kesimpulan, kami mendapati bahawa GONR pendek adalah bahan yang berpotensi untuk produk penjagaan kulit kerana pelbagai sifat biofungsinya (Rajah 6). Keputusan menunjukkan bahawa nanokarbon memainkan peranan sebagai antioksidan ekstrasel dan intrasel. Sementara itu, nanokarbon menghalang aktiviti tyrosinase dan kandungan melanin dan tidak menyebabkan sebarang kecederaan serius pada sel pigmen. Kerja ini mewujudkan fungsi anti-melanogenesis bagi empat jenis nanokarbon; kajian masa depan akan mengkaji mekanisme sebatian ini pada gen tertentu dan ekspresi protein yang berkaitan dengan kematangan melanin, pengangkutan, dan pengumpulan.

Cistanche meningkatkan pemutihan.

Sila klik gambar dan dapatkan butiran lanjut.