Kesan Anti-Penuaan Ribes Meyeri Anthocyanin Pada Sel Stem Neural Dan Tikus Penuaan Bahagian 2

Sila hubungioscar.xiao@wecistanche.comuntuk maklumat lanjut

Nar menyelamatkan fenotip senescent 23M-NSC

Anthocyanin R. Meyer kaya dengan pelbagai jenis flavonoid dan komponen bioaktif [1,3-5]. Untuk menentukan komponen antosianin R. Meyer yang mana memainkan peranan penting dalam anti-penuaan, kami melakukan analisis metabolomik R. Meyer antosianin. Kami mendedahkan bahawa Nar mungkin merupakan metabolit flavonoid yang penting kerana laluan biosintetik flavonoid sangat diperkaya dalam anthocyanin R. Meyer (Jadual Tambahan 1). Untuk menentukan kesan anti-penuaan Nar, pelbagai kepekatan (0, 1.7,3.4,6.8,13.6, dan 27.2 ug/mL) telah digunakan pada ujian 23M-NSC dan CCK-8 digunakan untuk menyiasat daya maju sel. Seperti yang ditunjukkan oleh Rajah 3 Tambahan, 6.8 ug/mL rawatan Nar meningkatkan daya maju sel sebanyak 150 peratus. Untuk meneroka lebih lanjut kesan anti-penuaan Nar, 23M-NSC telah dirawat dengan Nar, dan penunjuk berkaitan penuaan dikesan. .kegunaan hesperidinDalam 23M-NSC yang dirawat dengan 6.8 ug / mL Nar, ekspresi mRNA p16nk4a dikurangkan (Rajah 3A). Nar juga memanjangkan telomer mNSC berbudaya dan meningkatkan sintesis DNA (Rajah 3B, 3C). Untuk meneroka lebih lanjut kesan Nar pada percambahan sel, kami melakukan pewarnaan imunofluoresensi Ki67, yang merupakan antigen nuklear sel mitosis yang dinyatakan sepanjang kitaran sel, kecuali dalam G0 [19,27]. Rawatan dengan percambahan sel dipertingkatkan Nar, seperti yang diukur dengan peningkatan bilangan sel Ki{13}}positif (Rajah 3D, 3E). Seterusnya, kami juga mengesan potensi pembezaan NSC ke dalam neuron. Sesungguhnya, rawatan Nar 6.8ug/mL turut meningkatkan bilangan sel positif MAP2-(Rajah 3F,3G). Keputusan ini secara konsisten menunjukkan bahawa Nar boleh membalikkan penuaan 23M-NSC.

Rajah 2. Ribes Meyer anthocyanin meningkatkan ingatan tetikus dan kebolehan pembelajaran dengan meningkatkan sel stem saraf (NSC). (A) Masa diambil untuk mencari platform. (B) Masa diambil untuk mula-mula sampai ke platform. (C) Purata halaju untuk mencari pelantar. (D) Berenang jarak sebelum menemui pelantar. (E. F)Rawatan dengan R.cistanche empayar yang hilangsetiap antosianin meningkatkan bilangan dan saiz neurosfera berbanding dengan kawalan. (G) Neurosfera dengan saiz 50-100 um telah ditambah bilangannya dengan rawatan antosianin R. Meyer pada tikus. Data dibentangkan sebagai min ± SD bagi tiga eksperimen bebas. *P<><0.01, and=""><0.0001 compared="" with="" untreated="" cells."n"="" indicates="" the="" number="" of="" animals="" in="" each="" experimental="">

Rajah 3. Kesan naringenin(Nar) pada penuaan sel stem neural tikus (MNC). (A) Ekspresi mRNA p16k4a diukur oleh qRT-PCR dalam 23M-NSCs dengan dan tanpa rawatan 6.8 ug / mL Nar selama 48 jam. (B) Pengagihan fasa kitaran sel 23M-NSC dirawat dengan Nar selama 48 jam dan sel kawalan. (C) Panjang telomere relatif 23M-NSC meningkat dengan ketara dengan rawatan Nar, (D) Imunofluoresensi Ki67 pewarnaan otot yang dirawat dengan Nar selama 48 jam, dengan pelabelan nuklear DAPI, (E) Kuantifikasi (D),(F) Wakil bidang pewarnaan MAP2 dan GFAPimmunofluorescence mNSC berbudaya selepas kawalan dan rawatan Nar. (G) Kuantifikasi (F). Data dibentangkan sebagai min± SD bagi tiga eksperimen bebas. *P<>< 0.01,="" and="">< 0.0001="" compared="" with="" untreated="">

Sila klik di sini untuk mengetahui lebih lanjut

Nar meningkatkan ingatan dan kognisi pada tikus yang semakin tua

Tahap kognitif menurun dengan penuaan, dan rawatan anti-penuaan boleh meningkatkan tahap kognitif [11, 28]. Untuk mengesahkan kesan antipenuaan Nar dalam Vivo, kami menyuntik 20 mg/kg Nar ke dalam tikus C57BL/6 yang sudah tua (12 bulan) melalui urat ekor. Ujian MWM digunakan untuk mengkaji memori spatial dan kebolehan kognitif tikus.pecahan flavonoid tulen mikronisasi 1000 mg kegunaanLebih 5 hari latihan berulang, masa yang diambil untuk tikus penuaan yang dirawat Nar untuk mencari platform secara beransur-ansur menurun berbanding dengan kumpulan kawalan (Rajah 4A). Keputusan ujian mendedahkan bahawa masa yang diambil untuk mula-mula sampai ke platform telah dikurangkan (Rajah 4B), manakala masa yang dihabiskan di zon platform telah meningkat (Rajah 4C). Tambahan pula, tikus penuaan yang dirawat Nar diperhatikan dalam zon platform pada frekuensi yang lebih tinggi daripada kumpulan kawalan (Rajah 4D). Bersama-sama, keputusan ini menunjukkan bahawa Nar boleh meningkatkan memori spatial dan kebolehan kognitif dalam tikus yang semakin tua.

Analisis penjujukan RNA darah yang dirawat Nar daripada tikus yang semakin tua

Untuk menyiasat mekanisme anti-penuaan khusus Nar, kami menganalisis profil ekspresi gen darah yang dirawat Nar daripada tikus penuaan menggunakan penjujukan RNA (RNA-seq). Hasilnya mendedahkan 1, 961 gen yang dinyatakan secara berbeza (DEG). Secara amnya, Nar menurunkan ekspresi gen, dan hanya sebilangan kecil gen yang dikawal selia berbanding dengan kumpulan kawalan yang tidak dirawat (Rajah 5A, 5B). Selain itu, gen laluan isyarat penting yang berkaitan dengan penuaan telah dikurangkan, terutamanya dalam laluan isyarat TNF (Rajah 5C).oteflavonoidKeputusan ini membayangkan bahawa Nar mempengaruhi laluan isyarat TNF, dengan itu sangat mempengaruhi fungsi TNF-a, yang terlibat dalam kemerosotan kognitif yang berkaitan dengan penuaan [29,30]. Oleh itu, kami memeriksa tahap TNF dalam plasma tikus. Hasil daripada ujian d immunosorbent (ELISA) berkaitan enzim

Rajah 4. Naringenin (Nar) meningkatkan daya ingatan dan kebolehan pembelajaran dalam tikus yang semakin tua. (A) Latensi melarikan diri tikus penuaan yang dirawat Nar adalah lebih pendek berbanding dengan kumpulan kawalan. (B) Masa yang diambil untuk mula-mula sampai ke platform adalah lebih pendek dalam tikus penuaan yang dirawat Nar berbanding kumpulan kawalan. (C) Tempoh masa yang dihabiskan di zon platform. (D) Kekerapan diperhatikan di zon platform untuk tikus penuaan yang dirawat Nar berbanding dengan kumpulan kawalan. Data dibentangkan sebagai min ±SD bagi tiga eksperimen bebas.*P<>< 0.01,=""><0.0001 compared="" with="" the="" control="" group."n"="" indicates="" the="" number="" of="" animals="" used="" for="" each="" experimental="" group.="" revealed="" that="" nar="" treatment="" led="" to="" the="" downregulation="" of="" plasma="" tnf-a="" levels="" (figure="" 5d).="" we="" also="" examined="" pl6ink4agene="" expression="" in="" the="" hippocampus="" of="" mice="" and="" demonstrated="" that="" nar="" treatment="" downregulates="" pl6ink4amrna="" expression(figure="">

Cistanche boleh anti-penuaan

PERBINCANGAN

Penuaan dikaitkan dengan peningkatan risiko penurunan kognitif serta kehilangan keupayaan pembelajaran dan ingatan [22,23]. Kehilangan neuron dan neurogenesis terjejas berkait rapat dengan disfungsi otak yang berkaitan dengan usia [11-13]. Oleh itu, meningkatkan bilangan neuron dan meningkatkan neurogenesis adalah penting untuk rawatan anti-penuaan. R. Meyer, tumbuhan yang kaya dengan flavonoid dan bahan bioaktif lain [1, 3-6], mempunyai banyak fungsi yang masih belum diterangkan. Dalam kajian ini, anthocyanin R. Meyer menggalakkan percambahan NSC dan meningkatkan pembentukan neurosfera dengan morfologi seragam. Rawatan anthocyanin R. Meyer juga meningkatkan fenotip penuaan selular, dengan pengurangan tahap ROS dan ekspresi gen P16nk4 yang berkaitan dengan penuaan, peningkatan fasa sintesis DNA dan telomer yang dipanjangkan.puritan vitamin cSelain itu, hasil pewarnaan imunofluoresensi mendedahkan bahawa anthocyanin R Meyer merangsang pembentukan neuron. Keputusan ini menunjukkan bahawa anthocyanin R. Meyer mempunyai kesan anti-penuaan pada mNSC, dan mungkin juga secara langsung menggalakkan pembentukan neuron secara in vitro. Tambahan pula, penurunan kognitif berkait rapat dengan penuaan [22, 23]. Keputusan MWM kami menunjukkan bahawa pentadbiran intragastrik R. Meyer anthocyanin meningkatkan memori ruang dan kebolehan pembelajaran dalam tikus yang semakin tua, dan juga meningkat

Figure 5. Tumor necrosis factor(TNF)-a plays an essential role in naringenin (Nar)-mediated anti-aging effects. (A) Summary of gene expressions in mouse blood, as determined by RNA-seq. (B)Heatmap showing differentially expressed genes (DEGs) in the blood between control and Nar-treated mice. DEGs were identified by a fold change of >2.0 atau<0.5. (c)bar="" graph="" showing="" the="" major="" correlated="" signaling="" pathways.="" (d)="" heatmap="" showing="" degs="" in="" the="" tnf="" signaling="" pathway="" (e)="" plasma="" tnf-a="" levels="" determined="" by="" enzyme-linked="" immunosorbent="" assay.="" (e)="" p16hka="" gene="" expression="" levels,="" as="" determined="" by="" qrt-pcr.="" data="" are="" presented="" as="" the="" mean="" ±="" sd="" of="" three="" independent=""><><><0.0001 compared="" with="" the="" control="" group.="" nsc="" and="" neuronal="" numbers="" in="" the="" hippocampus="" of="" aging="" mice.="" these="" results="" suggest="" that="" r.="" meyer="" anthocyanins="" may="" enhance="" cognitive="" function="" by="" increasing="" nsc="" proliferation="" and="">

Penggunaan analisis metabolomik untuk menyiasat komposisi khusus antosianin R. Meyer mendedahkan bahawa Nar mungkin merupakan metabolit flavonoid yang penting. Nar sebelum ini telah dilaporkan untuk memperbaiki penuaan sel miokardium [31], meningkatkan kapasiti metabolik saluran usus [32], dan memberikan kesan anti-radang [33] dan anti-kanser [34]. Walau bagaimanapun, kesan Nar pada NSC semasa penuaan masih tidak diketahui. Untuk meneroka kesan anti-penuaan R. Meyer anthocyanin, kami menjalankan kajian lanjut menggunakan Nar. Rawatan dengan 6.8 ug/mL Nar meningkatkan daya maju sel, mengurangkan ekspresi gen P16ink4a, memanjangkan telomer, dan menggalakkan pembezaan NSC kepada neuron secara in vitro. Untuk menilai lebih lanjut kesan Nar pada percambahan sel, kami melakukan kajian imunofluoresensi. Keputusan menunjukkan bahawa rawatan Nar meningkatkan kedua-dua bilangan Ki{11}}sel positif dan bahagian MAP{12}}sel positif, menunjukkan bahawa Nar mungkin menggalakkan neurogenesis. Tambahan pula, kesan Nar terhadap pembelajaran dan ingatan juga dinilai dalam tikus yang semakin tua. Keputusan ujian MWM secara konsisten menunjukkan bahawa rawatan Nar meningkatkan penyampaian spatial dalam tikus yang semakin tua. Menariknya, analisis RNA-seq mendedahkan bahawa Nar boleh menjejaskan penuaan melalui laluan isyarat TNF, terutamanya dengan menurunkan kawal selia ekspresi TNF-a dalam darah tikus yang semakin tua. Ujian ELISA juga menunjukkan bahawa rawatan Nar mengurangkan tahap TNF-a plasma berbanding dengan tikus penuaan kawalan. TNF-a ialah faktor utama dalam laluan isyarat TNF dan berkait rapat dengan penuaan kognitif. Fungsinya termasuk menggalakkan perubahan patologi dalam sinaps hippocampal [29] dan perencatan percambahan sel prekursor [35]. Tahap TNF yang diubah dikaitkan dengan kemerosotan kognitif dalam kemurungan, skizofrenia, gangguan bipolar, dan penyakit Alzheimer [30,36,37]. Lebih khusus lagi, TNF-a dikawal selia pada pesakit dengan penyakit Alzheimer [38].

Ringkasnya, kajian kami menunjukkan bahawa anthocyanin R. Meyer meningkatkan kesan penuaan dalam NSC melalui Nar, yang merendahkan tahap TNF-a dalam vivo dan meningkatkan kognisi dalam tikus penuaan. Secara kolektif, penemuan kami menyediakan strategi baru untuk pembangunan rawatan klinikal, bertujuan untuk merealisasikan nilai perubatan R.Meyer anthocyanin yang lebih tinggi.

BAHAN DAN KAEDAH

Haiwan eksperimen

Kajian ini telah diluluskan oleh Jawatankuasa Penjagaan Haiwan Universiti Tongji dan dijalankan mengikut garis panduan institusi. Anthocyanin R. Meyer ditadbir secara intragastrik selama 2 bulan hingga 12-tikus berumur sebulan yang dikekalkan pada latar belakang C57BL/6. Nar telah disuntik ke dalam vena ekor selama 1-bulan hingga 12- bulan tikus yang dikekalkan pada latar belakang C57BL/6. Tikus kawalan diberi jumlah garam penampan fosfat (PBS) yang sama.

Penyediaan R. Meyer anthocyanin dan Nar

Buah R. Meyer(500 g) telah dihomogenkan menggunakan penghomogen tisu dan digantung dalam 1 L metanol yang mengandungi 0.1 peratus asid hvdroklorik. Pengekstrakan ultrasonik dilakukan tiga kali selama 30 minit pada suhu bilik. Ekstrak telah digabungkan, dan metanol dipekatkan di bawah tekanan yang dikurangkan untuk mendapatkan ekstrak R Meyer. Ekstrak telah disucikan lagi dengan resin makroporous AB-8 untuk meningkatkan kandungan antosianin.

Naringenin(C15H1205; MW:272.25; ketulenan: Lebih daripada atau sama dengan 98 peratus ; gred HPLC) telah dibeli daripada Chengdu Push Biotechnology Co. Ltd.(Sichuan, China) dan disimpan pada 2 darjah {{6 }} darjah dalam persekitaran kering tanpa cahaya. Kepekatan larutan stok ialah 100 mM dalam dimetil sulfoksida (DMSO). Kepekatan akhir DMSO tidak melebihi 0.1 peratus dalam medium kultur.

Ujian neurosfera dan pembezaan

NSC diperoleh daripada tetikus SVZ. Tikus telah dikorbankan selepas bius dan SVZ dibedah dengan teliti dan diasingkan ke dalam sel tunggal dengan 0.4 U/mL papain(Imogen, Alexandria, VA, USA; Cat No: LS003126). NSC disalut dalam pinggan 10 cm yang mengandungi 10 mL NSC Basal Medium dengan 10 ng/mL EGF(PeproTech,Cranbury,NJ, USA; Cat No:AF-100-15) dan 10 ng/mL FGF (PeproTech, Cranbury, NJ , AS; Cat No:AF-100-18B). Neurosfera dilalui setiap 5 hari. NSC daripada laluan baru{10}} neurosfera yang dipisahkan telah disemai pada laminin(Gibco, Gaithersburg, MD, USA; Cat No:23017015) dan poly-L-ornithine hydrobromide (Poly-L; Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA ; Cat No: P3655)-gelongsor kaca bersalut dalam NSCBasalMedium tanpa tambahan pembezaan. Sel yang dibezakan telah diimunisasikan untuk Tu1(beta-tubulin II; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA; Cat No:480011), MAP2(Thermo Fisher Scientific, Cat No: MA5-12826), dan protein berasid fibrillary glial (GFAP; Thermo Fisher Scientific, Cat No. PA5-16291), dan kemudian diwarnai balas dengan 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; Thermo Fisher Scientific, Cat No: D1306). Slaid diperiksa menggunakan mikroskop Olympus BX53 (Olympus, Madison, WI, Amerika Syarikat). Kuantifikasi sel positif TuJ1- dan MAP2-dilakukan dengan mengira sel berlabel daripada tiga eksperimen bebas. Analisis statistik dilakukan menggunakan ujian-t tidak berpasangan.

Artikel ini diekstrak daripada www.aging-us.com AGING 2020, Vol. 12, No. 17