Kesan Anti-Penuaan Leontopodium Alpinum (Edelweiss) Ekstrak Budaya Callus Melalui Profil Transkripome

Sila klikoscar.xiao@wecistanche.comuntuk maklumat lanjut

Abstrak:Edelweiss (Leontopodium Alpinum) dalam keluarga Asteraceae adalah bunga liar yang tumbuh di tempat batu kapur berbatu. Di sini, kami menyiasat keberkesanan ekstrak budaya kalus edelweiss (ekstrak budaya kalus Leontopodium Alpinum; LACCE)menggunakan pelbagai ujian dari in vitro hingga in vivo serta profil transkrip. Beberapa keputusan ujian in vitro menunjukkan aktiviti antioksidan LACCE yang kuat sebagai tindak balas kepada rawatan UVB. Lebih-lebih lagi, LACCE menindas keradangan dan kedutan; Walau bagaimanapun, aktiviti pelembap telah meningkat oleh LACCE. Ujian klinikal dalam vivo menunjukkan bahawa penggunaan berterusan LACCE pada muka dan tisu kulit meningkatkan kedutan anti-periorbital, keanjalan kulit, ketumpatan dermal, dan ketebalan kulit berbanding dengan plasebo. Keputusan RNA-Sequencing menunjukkan sekurang-kurangnya 16.56% gen manusia dinyatakan dalam sel keratinosit. LACCE gen terkawal yang merangkumi beberapa protein KRT; DDIT4, BNIP3, dan IGFBP3 terlibat dalam peraturan positif proses perkembangan, kematian sel yang diprogramkan, keratinisasi, dan cornifikasi membentuk halangan kulit, yang memberikan banyak kelebihan kepada kulit manusia. Sebaliknya, gen yang dikawal rendah adalah gen responsif tekanan, termasuk logam, pengoksidaan, luka, hipoksia, dan jangkitan virus, menunjukkan LACCE tidak menyebabkan sebarang tekanan berbahaya pada kulit. Kajian komprehensif kami menunjukkan bahawa LACCE adalah ejen yang menjanjikan untuk kosmetik anti-penuaan.

Kata kunci:anti-penuaan; callus; edelweiss;sel kulit;transkripome

1. Pengenalan

Edelweiss(Leontopodium noble sub sp. Alpinum(Cass.) Greuter) dalam keluarga Asteraceae adalah bunga liar yang tumbuh di tempat - tempat batu kapur berbatu di ketinggian tinggi, seperti Pegunungan Alpen Swiss [1.2]. Oleh kerana jarang bunga putihnya yang berumur pendek, edelweiss mewakili keindahan dan kesucian yang berkaitan dengan Alps dan Carpathians. Di samping itu, banyak negara, termasuk Austria, Bulgaria, Romania, Slovenia, dan Switzerland, menganggap edelweiss sebagai simbol kebangsaan.

Sila klik di sini untuk mengetahui lebih lanjut

Untuk masa yang lama, edelweiss telah digunakan sebagai ubat tradisional terhadap sakit perut, bronkitis, cirit-birit, disentri, dan demam [3, A]. Baru-baru ini, beberapa kajian telah menunjukkan keberkesanan ekstrak edelweiss untuk anti-radang pada tikus dan tikus [3] dan keratinosit manusia dan sel endothelial [4]. Di samping itu, ekstrak akar edelweiss mengandungi konstituen yang meningkatkan neurotransmisi cholinergic, menunjukkan potensinya untuk agen antidementia [5] dan antioksidan, seperti

asid leontopodic A dan asid 35-caffeoylquinic, yang boleh digunakan sebagai agen anti-penuaan [6]. Selain itu, ekstrak edelweiss menunjukkan aktivitas antibakteria terhadap Enterococcus faecium, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumonia, dan Streptococcus pyogenes, menunjukkan kemungkinan penggunaan etnomedicinal mereka untuk gangguan pernapasan dan perut [7].

Beberapa kajian terdahulu telah menganalisis sebatian ekstrak edelweiss. Sebagai contoh, kaedah kromatografi kapilari mendedahkan 12 sebatian penting farmakologi, termasuk flavonoid, asid kafe, dan asid leontopodic, dari bahagian udara edelweiss [8]. Untuk mengekstrak antioksidan dari tumbuhan edelweiss, kromatografi partition empar (CPC) dan kaedah kromatografi cecair berprestasi tinggi (HPLC) telah dibangunkan [6]. Adalah diketahui bahawa sebatian aktif ekstrak edelweiss antara bahagian udara dan akar adalah pelbagai[3]. Sebagai contoh, akar berbulu edelweiss menghasilkan lignans aktif farmakologi, seperti log masuk dan 5-methoxy-login, yang boleh dirangsang oleh beberapa komponen lain, seperti nitrat perak, sukrosa, metil jasmonate, dan ekstrak yis [9].faedah ekstrak cistancheTambahan pula, corak metabolik 11 spesies Leontopodium yang berbeza telah didedahkan oleh spektroskopi resonans magnetik nuklear (1H NMR) dan spektrometri jisim kromatografi cecair (LC-MS) dalam hubungan taksonomi mereka [10].

Cistanche boleh anti-penuaan

Kalus tumbuhan boleh ditakrifkan sebagai jisim sel yang tidak teratur atau tidak dibezakan, yang mudah disebabkan oleh luka untuk menutup luka tumbuhan atau secara buatan menjalankan sistem in vitro. Kalus tumbuhan dikulturkan secara buatan dengan menambah nutrien dan pengawal selia pertumbuhan tumbuhan dalam keadaan pertumbuhan antiseptik. Pada masa ini, adalah mungkin untuk menghasilkan sebilangan besar sel tumbuhan tertentu dengan kualiti yang sama dalam bioreaktor. Selain itu, sel tanaman memiliki kesanggupan yang disebut sebagai totipotency, yang merupakan potensi genetik sel tanaman untuk menghasilkan seluruh tanaman yang matang [11]. Oleh itu, adalah mungkin untuk menjana tumbuhan matang dari kalus tumbuhan tertentu. Selain itu, kalus dapat digunakan secara luas untuk regenerasi tanaman untuk melestarikan tanaman langka dan terancam [12.13].

Seperti sel haiwan, sel tumbuhan mempunyai kebolehan untuk memudahkan rangsangan dan pertumbuhan semula tumbuhan selepas kecederaan [14]. Walaupun sel stem tumbuhan dianggap sebagai bahan baru muncul dalam industri kosmetik, bahan yang ada adalah terhad. Adalah penting untuk mengenal pasti sumber tumbuhan baru dan menilai komponen fungsinya yang berkaitan dengan kosmetik.

Ekstrak Edelweiss terkenal dengan penggunaannya dalam agen farmaseutikal; Walau bagaimanapun, kesan ekstrak edelweiss sebagai sumber kosmetik semulajadi jarang dilaporkan. Di sini, kami menyiasat keberkesanan ekstrak edelweiss callus (ekstrak budaya kalus Leontopodium Alpinum; LACCE) berasal dari daun edelweiss menggunakan pelbagai ujian dari in vitro hingga in vivo dan mendedahkan mekanisme molekul yang disebabkan oleh LACCE menggunakan profil transkripon.

2. Bahan dan Kaedah

2.1. Pengeluaran Edelweiss Callus

Benih Edelweiss dibeli secara komersial. Biji edelweiss direndam dalam 70% etanol untuk tahun 30-an diikuti dengan mencuci dengan air suling. Sekali lagi, benih digoncang dalam 0.3% natrium hipoklorit (Waco, Osaka, Jepun) selama 20 minit dan dibasuh dengan air suling. Benih yang disterilkan bercambah pada medium asas Murashige dan Skoog (MS) (Duchefa Biochemie, Haarlem, Belanda). Daun edelweiss dalam keadaan aseptik dipotong menjadi kepingan kecil (0.5 hingga 1 cm). Kami menyebabkan peringkat awal sel tumbuhan pada medium MS yang mengandungi 0.5-3 mg / mL 6-Benzylaminopurine (6-BAP)(Duchefa Biochemie) dan 0.3-1 mg / mL 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D)(Duchefa Biochemie) dalam kegelapan pada 25± 2 ° C [15]. pH medium MS diselaraskan kepada 5.8 menggunakan 1N NaOH (Duchefa Biochemie). Kalus yang disebabkan disebarkan dalam hidangan petri. Talian kalus yang dipilih telah dikulturkan dalam bioreaktor di Institut Penyelidikan Anti-Penuaan BIO-FD&C Co., Ltd., Incheon, Korea. Kalus berbudaya dipanen dan dicuci tiga kali dengan air suling.cistanche genghis khanKalus itu dehidrasi menggunakan pengering beku (IlShinbioBase, Dongducheonsi, Korea) mengikut arahan pengeluar. Kalus edelweiss kering dikacau dalam air suling pada suhu 50 °C selama 8 h. Ekstrak callus diperolehi dengan pengekstrakan haba pada 98 ° C selama 10 minit.

2.2. Budaya Sel Kulit Manusia

Kesan yang dinilai ekstrak edelweiss pada sel kulit manusia, sel keratinocyte (HaCaT), dan manusia normal Detroit 551 fibroblast (ATCC, Manassas, VA, Amerika Syarikat)ditanam di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)(Welgene, Gyeongsan-si, Korea) ditambah dengan 10% serum lembu janin (FBS)(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Amerika Syarikat) dan 1% antibiotik-antimikotik (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, AMERIKA Syarikat) pada 37 °C dengan keadaan CO2 5%.

2.3. Penilaian Aktiviti Metabolik Sel oleh MTT Assay

Untuk menilai sitotoksisitas LACCE pada pertumbuhan sel, penyebaran, dan kelangsungan hidup sel kulit manusia, ujian MTT (3-(45-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) telah dijalankan seperti yang diterangkan sebelum ini[16,17]. Secara ringkas, sel HaCaT dan Detroit 551 pada ketumpatan 5×10* sel masing-masing, diinkubasi dalam plat 96-baik untuk 24 h.Selepas itu, kepekatan akhir 0.1%, 0.5%, dan 1% LACCE dirawat selama 24 jam. Air suling digunakan sebagai kawalan. Selepas rawatan LACCE, medium telah dikeluarkan diikuti dengan penambahan 4 μLof 5 mg/mL MTT(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Syarikat)dan diinkubasi selama 4 jam. Selepas mengeluarkan medium,100 μL dimethylsulfoxide (DMSO)(Sigma)telah ditambah dan dibubarkan selama 10 minit.cistanche life extensionPenyerapan panjang gelombang diukur pada 570 nm menggunakan Thermo Scientific Multiskan GO Microplate Spectrophotometer (Fisher Scientific Ltd., Vantaa, Finland). Daya maju sel diperolehi menggunakan formula berikut. Daya maju sel (%)=(jumlah penyerapan untuk sel yang dirawat/jumlah penyerapan sel kawalan)× 100.

2.4. Penilaian Aktiviti Antioksidan oleh DPPH Assay

Aktiviti antioksidan LACCE diukur dalam ujian DPH (2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazine-hydrate) seperti yang diterangkan sebelum ini [18]. Secara ringkas, 0.1 mL kepekatan akhir 0.1%, 0.5%, dan 1%LACCE dirawat dalam 0.1 mL daripada 0.1 mM DPPH (Sigma-Aldrich) dengan kehadiran 0.4 mL etanol. Kami menggunakan 0.001% asid askorbik (vitamin C)(Sigma-Aldrich) sebagai kawalan positif. Sampel dicampur dengan baik selama 10-an dan diinkubasi pada suhu bilik dalam keadaan gelap selama 30 minit. Penyerapan panjang gelombang diukur pada 517 nm menggunakan Thermo Scientific Multiskan GO Microplate Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Aktiviti scavenging radikal dikira menggunakan formula berikut. Aktiviti Scavenging (%)=[1-(penyerapan sampel ujian/penyerapan kawalan)]×100.

2.5. Penilaian Aktiviti Antioksida oleh Hidrogen Peroksida(H2O2) Assay

Hidrogen peroksida menghasilkan radikal bebas oksigen dalam sel, mengakibatkan kematian sel. Kami menguji tingkat kematian sel yang disebabkan oleh hidrogen peroksida dalam sampel yang dirawat LACCE. Sel HaCaT pada ketumpatan 5×105 sel per telaga telah diinkubasi dalam plat 24-baik untuk 24 h. Selepas itu, kepekatan akhir 0.1%,0.5%,dan1%LACCE dirawat dengan kehadiran 1 mM H, O, untuk 8h. Sebagai kawalan positif, 0.033% NAC (Sigma-Aldrich) digunakan. Ujian MTT digunakan untuk mengukur kadar survival sel sampel yang dirawat LACCE yang disebabkan oleh HO2. Di samping itu, kami memerhatikan morfologi sel oleh pewarnaan biru metilena (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Syarikat).

2.6. Transkripsi Terbalik Masa Nyata (RT)-PCR

Untuk mengkaji kesan LACCE pada anti-kedut, pelembap, dan anti-radang, kami menjalankan RT-PCR masa nyata dengan primer yang diketahui menguatkan gen penanda menggunakan QuantiTect Primer Assays (Qiagen, Hilden, Jerman) mengikut arahan pengeluar. Detroit 551 sel pada ketumpatan 5×104 sel per telaga telah diinkubasi dalam plat 96-baik untuk 24 h. Selepas itu, kepekatan akhir 0.1%,0.5%, dan 1% LACCE dirawat selama 24 h. cDNA disintesis dari detroit 551 sel masing-masing yang dirawat dengan kepekatan LACCE yang berbeza menggunakan SuperPrep Cell Lysis & RT Kit untuk qPCR (Toyobo, Osaka, Jepun) yang mengandungi reagen lysis dan reagen RT mengikut arahan pengeluar. Untuk kesan anti-kedut semasa rawatan LACCE, ungkapan pengekodan gen Matrix Metalloproteinase-2 (MMP-2) telah diukur oleh RT-PCR masa nyata menggunakan kit Campuran Thunderbird SYBR qPCR (Toyobo)berdasarkan arahan pengeluar. Untuk penilaian melembapkan melalui rawatan LACCE, ungkapan pengekodan gen Aquaporin 3 (AOP3) telah diperiksa oleh RT-PCR masa nyata. Dalam kes ujian anti-radang, sel HaCaT pada ketumpatan 5×104 sel per telaga telah diinkubasi dalam plat 96-baik untuk 24h. Selepas mengeluarkan medium, UVB disinari pada sel HaCaT. Untuk penyinaran UVB, 5 mJ/cm' digunakan oleh kotak UV CL-1000 (Analytik Jena AG, Jena, Jerman). Selepas itu, kepekatan akhir 0.1%,0.5%, dan 1% LACCE dirawat untuk 4j. Kami menggunakan dexamethasone(Dex)(Sigma-Aldrich) sebagai kawalan positif. Untuk kesan anti-radang rawatan LACCE, ungkapan gen yang pengekodan COX2 dan iNOS, masing-masing, diukur oleh RT-PCR masa nyata. Ungkapan gen individu telah dinormalisasi kepada ungkapan gen GAPDH. 2.7. Penilaian Klinikal LACCE sebagai Ejen kosmetik di Vioo

Satu kajian klinikal untuk penilaian keberkesanan LACCE pada mengangkat muka dan meningkatkan kedutan periorbital, keanjalan kulit, ketumpatan dermal, dan ketebalan kulit telah dijalankan oleh syarikat Ellead selepas kelulusan berdasarkan prosedur operasi standard (Ver. 3.0) (Ellead, Seongnam, Korea) Ellead IRB mengikut garis panduan Amalan Klinikal Baik Korea (B1-2015-4-002) yang diterangkan oleh Kementerian Keselamatan Makanan dan Dadah (MFDS) dan Prosedur Operasi Standard Ellead (EL-P-7400).

Untuk mengkaji kesan LACCE in vivo, kami menjalankan penilaian klinikal LACCE untuk empat faktor yang berbeza: mengangkat muka dan meningkatkan kedutan periorbital, keanjalan kulit, ketumpatan dermal, dan ketebalan kulit. Untuk ini, sejumlah 21 sukarelawan wanita dengan purata 48.04 ± 4.28 tahun yang dibahagikan kepada 12 sukarelawan berusia 40-an dan sembilan sukarelawan berusia 50-an, mengambil bahagian dalam penilaian klinikal selama empat minggu.

Ujian klinikal dijalankan pada tiga titik masa yang berbeza, garis dasar, 2 minggu, dan 4 minggu, untuk semua sukarelawan. Dari seminggu sebelum permulaan kajian hingga akhir, semua sukarelawan tidak menjalani rawatan tambahan untuk memperbaiki kulit, kosmetik, dan bantuan kebersihan, yang boleh menjejaskan hasilnya. Selepas mencuci muka sukarelawan menggunakan buih pembersih, sukarelawan berdiri selama sekurang-kurangnya 30 minit di dalam bilik terkawal dengan suhu malar (20-24 ° C) dan kelembapan (40% -60% kelembapan relatif). Kami melakukan pengukuran secara rawak di sebelah kiri atau kanan wajah sukarelawan. Ujian kami adalah ujian dua buta di mana subjek atau penyelidik tidak tahu produk mana yang merupakan sampel ujian. Formulasi untuk mengira penurunan dan kenaikan kadar diterangkan dalam Jadual 1.

2.8. Pengukuran Mengangkat Muka dan Meningkatkan Kedutan Periorbital

Di garis dasar, kedutan periorbital, keanjalan kulit, ketumpatan dermal, ketebalan kulit pada pipi, dan mengangkat muka di sudut mulut diukur untuk semua sukarelawan. Selepas itu, dua sampel yang berbeza, LACCE, dan plasebo (kawalan), digunakan pada kawasan muka yang ditetapkan dua kali sehari (pagi dan malam). Sukarelawan dibahagikan kepada dua kumpulan yang berbeza, kumpulan I (LACCE digunakan pada bahagian muka kiri manakala plasebo digunakan pada bahagian muka kanan) dan kumpulan II ( plasebo digunakan pada kawasan muka kiri manakala LACCE digunakan pada kawasan muka kanan). Dua dan empat minggu selepas rawatan, pengukuran yang sama telah dijalankan untuk menilai kesan LACCE berbanding dengan plasebo.

Kedut periorbital dianalisis menggunakan sistem pengukuran kulit 3D(dimensi) optik PRIMOS High Resolution (Canfield Scientific, Parsippany, NJ, Amerika Syarikat), yang sesuai untuk penyiasatan mikrostruktur dan kedutan kulit. Dua parameter kekasaran yang berbeza, Ra (kekasaran purata), yang merupakan purata nilai mutlak ketinggian profil profil kekasaran, dan Rg (root min kekasaran kuasa dua), yang merupakan min akar purata kuasa dua ketinggian profil profil kekasaran, telah diukur.

Artikel ini diekstrak dari Gen 2020, 11, 230; doi:10.3390/genes11020230 www.mdpi.com/journal/genes