Kenalan:jerry.he@wecistanche.com

Mi Young Ahn1*, Ban Ji Kim1, Ha Jeong Kim1, Jae Sam Hwang1, Yi-Sook Jung2 dan Kun-Koo Park3

Cistanche mempunyai kesan anti-penuaan

Abstrak

Latar Belakang: Kajian ini bertujuan untuk menilaianti penuaankesan sebatian terbitan serangga yang baru disediakan, glikosaminoglycan kumbang tahi (GAG), diberikan secara intraperitoneal kepada tikus SD lama sebagai sebahagian daripada diet mereka selama 1 bulan. Pentadbiran GAG serangga didapati berkaitan dengan pengurangan kerosakan oksidatif, tahap biomarker hepato-selular, kandungan karbonil protein, dan kepekatan malondialdehid. Theanti penuaan-mekanisme genetik molekular kumbang tahi GAG masih belum dijelaskan sepenuhnya.

Keputusan: Catharsius molossus (sejenis kumbang tahi) GAG (CaG) dimilikianti penuaanaktiviti; ia mengurangkan tahap serum kreatinin kinase, mempunyai aktiviti vasorelaxant aorta dan tindakan kardioprotektif, dan mengekalkan tahap glukosa normal dalam tikus yang dirawat. Analisis mikroarray dilakukan dengan tatasusunan set klon cDNA 30 K tikus untuk mengenal pasti profil ekspresi gen 14-tikus SD berumur sebulan yang dirawat dengan kumbang tahi glycosaminoglycan 5 mg/kg (CaG5) sepanjang 1- tempoh bulan, yang dilakukan untuk menyiasatnyaanti penuaankesan berbanding dengan sama ada Bombus ignitus (sejenis kumbang) ratu GAG 5 mg/kg (IQG5) atau kondroitin sulfat 10 mg/kg. CaG5 dan IQG5 telah menandakan kesan anti-radang, membawa perencatan asid lemak bebas, asid urik, sGPT, IL-1 beta dan nilai CK. Di samping itu, kesan antikoagulan dan antitrombotik dilihat: kepekatan faktor 1 (fibrinogen) meningkat dalam plasma tikus yang dirawat CaG. Kumpulan tikus5-yang dirawat CaG, berbanding dengan kawalan, memaparkan upregulation 131 gen, termasuk lipocalin 2 (Lbp) dan perencat peptidase serine, Kaszal type3 (Spink3) dan 64 gen terkawal, termasuk lysyl oxidase (Lox ), serine dehydratase (sds), dan retinol saturase (Retsat).

Kesimpulan: Data kami mencadangkan bahawa glycosaminoglycan kumbang tahi boleh menjadi rawatan yang berguna untuk tikus tua, yang menunjukkan potensinya sebagai biobahan terapeutik untuk penuaan.

Kata kunci: Kesan anti-penuaan, Kumbang tahi (Catharsius molossus), Ratu B. ignitus, Glycosaminoglycan

Latar belakang

digunakan, dengan cara penulenan, pengekstrakan, dan pengenalpastian juzuk aktif yang kuat, sebagai makanan berfungsi atau ubat. Ekstrak kumbang tahi Catharsius molossus, yang ditemui di China, menunjukkan aktiviti fibrinolitik yang ketara dan kesan anti-oksidatif dan anti-hiperglisemik pada tikus yang diberi diet tinggi lemak [9, 10]. Kandungan karbonil protein dalam darah dan kepekatan malondialdehid tisu hati yang dirawat dengan etanol kumbang tahi atau ekstrak aseton dalam tempoh 1-sebulan, telah menurun dengan ketara berbanding kawalan [10]. Baru-baru ini, peptida kumbang tahi Korea, LLCIALRKK-NH2, yang merupakan 9-mer peptida yang diperoleh daripada Copris tripartitus Coprisin, didapati mempunyai aktiviti bakteria terhadap E. coli dan aktiviti antimikrob dengan menyebabkan kerosakan DNA yang teruk , yang mendorong kematian seperti apoptosis [11]. Produk apikultur, ekstrak alkohol B. ignitus queen (BIQ) mempunyai potensi keberkesanan tertinggi di kalangan semua ekstrak lebah yang diuji untuk merawat keradangan pada tikus SD, kerana ia mengurangkan edema kaki dengan ketara [12]. Jadi, kami menyediakan GAG yang diperoleh daripada bilangan C. molossus atau B. ignitus queens yang boleh diperoleh terbanyak untuk menguji merekaanti penuaanharta benda. Penuaan melibatkan penurunan progresif dalam kapasiti fisiologi organisma, dan dimanifestasikan oleh perubahan terkumpul dan ketidakstabilan di peringkat keseluruhan sistem [13]. Penuaan juga dikaitkan dengan corak ekspresi gen pembezaan yang menunjukkan tindak balas tekanan yang berkurangan di kalangan gen metabolik dan biosintetik [14]. Khususnya, peningkatan yang berkaitan dengan usia atau obesiti dalam tisu adiposa visceral biasanya disertai dengan keradangan kronik gred rendah, yang telah dianggap sebagai punca pelbagai penyakit metabolik termasuk kanser, penyakit kardiovaskular, dan, yang paling ketara, jenis. dua diabetes [15]. GAG serangga ini boleh digunakan dalam bidang yang pesat membangun dengan prospek menggunakan kejuruteraan tisu dan biomaterial sebagai terapi baru [16].

Dalam kajian ini, kami melaporkan bahawa GAG daripada kumbang tahi dan BIQ dipaparkananti penuaansifat dan, oleh itu, sebatian ini memegang janji yang besar untuk digunakan sebagaianti penuaanejen. Selain itu, kami menunjukkan nilai potensi kumbang tahi C. molossus glycosaminoglycan dalam mengurangkan aspek penuaan yang memudaratkan, seperti yang diukur dalam kedua-dua serum dan dalam corak ekspresi gen 14-tikus SD berumur sebulan selepas rawatan selama 1 bulan.

Kaedah

Bahan

Penyediaan glikosaminoglikan serangga

C. molossus kering telah dibeli di pasaran tempatan di China; lebah (ratu Bombus ignitus) diternak dan dikeringkan secara beku, di Jabatan Biologi Pertanian, Akademi Sains Pertanian Kebangsaan, Korea Selatan. Chondroitin sulfate dan semua reagen telah dibekalkan dari Sigma Aldrich (St. Louis, Mo., Amerika Syarikat).

Setiap satu kilogram (1 kg) serangga kering direndam dan diekstrak tiga kali dengan etanol secara ultrasonifikasi (Branson, Colorado, MI, Amerika Syarikat) selama 30 min. Sisa yang diasingkan daripada ekstrak alkohol telah dinyahlemak dua kali dengan 2 isipadu aseton. Kira-kira 200 g serbuk kering, dinyahlemak dan dihancurkan digantung dalam 2 L 0.05 M penampan natrium karbonat (pH 9). Suspensi telah diinkubasi selama 48 jam pada 60 darjah selepas menambah 28 ml (1.4 peratus ) Alcalase (Sigma Aldrich, St. Louis, Mo., Amerika Syarikat). Campuran pencernaan telah disejukkan kepada 4 darjah, dan asid trikloroasettik ditambah kepada kepekatan akhir sebanyak 5 peratus. Sampel dicampur, dibiarkan selama 1 jam, dan kemudian disentrifugasi selama 30 minit pada 8000 × g (Hanil Science Industrial, Incheon, Korea Selatan). Tiga isipadu 5 peratus kalium asetat dalam etanol telah ditambah kepada satu isipadu supernatan. Selepas mencampurkan, ampaian disimpan semalaman pada suhu 4 darjah dan kemudian disentrifugasi. Mendakan berjumlah 20 g telah dilarutkan dalam 40 ml 0.2 M NaCl dan disentrifugasi. Cetylpyridinium chloride (5 peratus ) ditambah kepada 0.2 kali ganda isipadu supernatan, dan mendakan dikumpulkan melalui sentrifugasi. Mendakan dibubarkan dalam 20 ml 2.5 M NaCl. Lima isipadu etanol ditambah, dan mendakan dipisahkan dengan sentrifugasi. Mendakan telah dilarutkan dalam air dan dialisis terhadap 100 isipadu air [17], dan glikosaminoglikan mentah yang didialisis telah dikeringkan beku untuk mendapatkan kira-kira 1.1 g CaG, 4.89 g IQG sebagai serbuk. GAG mentah telah dimuatkan pada lajur kromatografi gel DEAE Sephadex A-25 (40 x 1.2 cm) yang diseimbangkan dengan penimbal fosfat 50 mM (pH 7.4). Pecahan telah dicairkan menggunakan kecerunan natrium klorida linear dari 0 hingga 2.5 M NaCl dalam penimbal fosfat pada kadar alir 20 ml/j, dan glycan yang didialisis telah dikeringkan beku kepada GAG tulen.

Haiwan

Tikus Sprague Dawley (SD) (jantan), pada umur 8-bulan, dibekalkan daripada Samtako Co. Ltd. (Osan, Korea). Semua prosedur adalah mengikut Garis Panduan NIH untuk Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Makmal. Semua eksperimen telah diluluskan oleh Jawatankuasa Etika Haiwan Makmal Akademi Sains Pertanian Kebangsaan, RDA, Korea Selatan (NAAS1503) dan mengikut garis panduan kebangsaan untuk penjagaan dan penggunaan haiwan (perumahan individu). Tikus telah disesuaikan selama 6 bulan di bawah keadaan penternakan biasa (23 ± 2 darjah C, kelembapan 55 ± 10 peratus dan kitaran cahaya/gelap 12 jam) dan diberi makanan biasa (D10001, AIN-76Diet tikus, Penyelidikan Diet Inc., New Brunswick, NJ, USA) dan air ad libi-tum. 14-Tikus berumur sebulan telah diasingkan kepada 4 kumpulan rawatan yang terdiri daripada 10 tikus setiap satu dan diagihkan mengikut persamaan berat (680.2 ± 9.20 g). Rawatan diberikan dalam PBS setiap hari dan masing-masing ditadbir secara intraperitoneal.

Kumpulan tersebut adalah kawalan, 5 mg/kg CaG (CaG5), 5 mg/kg IQG (IQG5), dan 10 mg/kg CS (CS10) (Sigma Aldrich Co., USA), diberikan. Setiap kumpulan dikekalkan mengikut diet biasa (AIN-76Diet tikus, Diet Penyelidikan) dan rawatan sampel selama 1 bulan (Skim 1).

Berat tisu adiposa

Nisbah lemak perut dan epididimis kepada berat badan telah ditentukan. Pengukuran adalah selepas pengorbanan pada akhir tempoh rawatan 1- bulan.

Ketumpatan adiposit

Organ-organ yang dipotong dan tisu adiposa telah ditetapkan 10 peratus formalin neutral. Selepas pembenaman parafin, mereka diwarnai dengan hematoxylin dan eosin, dan Toluidine blue O, diperiksa oleh mikroskop cahaya (Leica CTR6000, Hesse, Jerman), dan difoto. Ketumpatan adiposit (sel / mm2) ditentukan dalam tisu yang dirawat dan dikawal oleh toluidine blue O stain (pembesaran asal, x400).

Pensampelan darah dan darah, plasma, ujian serum

Pada empat kumpulan bernama CON, CaG5, IQG5, CS10 (n =10), selepas 1 bulan rawatan, darah (~5 ml) dikumpulkan dari vena kava posterior di bawah penyedutan CO2 ringan dan digunakan untuk pengukuran kimia serum. Parameter yang diperiksa termasuk fosfolipid, asid hyaluronik, asid lemak bebas, albumin, alkali fosfatase (ALP), glutamic oxaloacetic transaminase (GOT), glutamic pyruvic transaminase (GPT), laktik dehidrogenase (LDH), CK (creatinine phosphokinase), glukosa. , jumlah trigliserida kolesterol, kolesterol HDL, kolesterol LDL, kreatinin, nitrogen urea darah (BUN), jumlah protein, asid urik dan protein c-reaktif (CRP). Semua parameter dinilai menggunakan penganalisis automatik (penganalisis klinikal automatik Hitachi 7060, Tokyo).

Pensampelan darah dan ujian plasma untuk pengesanan aktiviti anti-koagulan

Selepas 1-bulan rawatan, kira-kira 4 ml plasma dikumpulkan dari vena kava posterior di bawah penyedutan CO2 ringan dan disentrifugasi. Supernatan digunakan untuk masa pembekuan sebagai ujian aktiviti antikoagulan: masa tromboplastin separa diaktifkan (APTT), masa trombin, masa protrombin, dan faktor 1 (fibrinogen) sebagai ujian aktiviti fibrinolitik menggunakan penganalisis klinikal automatik yang disebutkan di atas mengikut manual Green Cross Lab.

Kerosakan lipid oksidatif

Untuk menentukan kerosakan lipid oksidatif dalam hepatosit tikus, paras malondialdehid (MDA) diukur dengan ujian peroksidasi lipid menggunakan kaedah warna yang melibatkan bahan reaktif asid thiobarbituric (TBARS) pada 535 nm [18].

Kerosakan protein oksidatif

Supernatan homogenat hati dan darah, yang diperolehi berikutan sentrifugasi digunakan untuk penentuan kandungan karbonil. Tekanan oksidatif protein dinilai dengan mengukur kandungan karbonil protein dalam darah. Kandungan karbonil ditentukan dengan immunoassay berkaitan enzim mengikut protokol pengilang untuk kit ELISA karbonil protein OxiSelect™ (Cell Biolabs, Inc., San Diego, CA, USA). Aktiviti CAT (protein U/mg) diukur berdasarkan penguraian pengantara CAT bagi H2O2 [19].

Penyediaan homogenat hati untuk pengesanan enzim oksidatif

Kira-kira empat kumpulan bernama CON, CaG5, IQG5, CS10, tisu hati telah dihomogenkan pada ais dalam 10-kali ganda penimbal lisis larutan pengekstrakan protein PRO-PREP™ (iNtRON, Busan, Korea). Supernatan homogenat hati selepas sentrifugasi (800 g, 10 min) telah diuji untuk katalase, glutathione peroksidase, glutathione s-transferase dan superoksida

aktiviti dismutase mengikut manual ujian (kit OxiSelect™ ELISA, Cell BioLabs, InC., San Diego, CA, USA).

Ujian sitokin IL-1 , IL-6 dan IL-10

Pada empat kumpulan yang dinamakan CON, CaG5, IQG5, CS10, paras IL- 1 atau IL − 6 atau IL − 10 dalam serum tikus yang dirawat GAG serangga diukur menggunakan kit Elisa komersial (Quantikine, R&D Systems, Inc , Minneapolis, MN, Amerika Syarikat) mengikut arahan pengilang.

Penyediaan RNA dan analisis PCR masa nyata kuantitatif

Jumlah RNA diasingkan daripada hati menggunakan reagen TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, Amerika Syarikat), dan kepekatan dan ketulenan RNA diukur menggunakan spektrofotometer UV / Vis (Beckman Coulter Co., Miami, FL, Amerika Syarikat). DNA pelengkap (cDNA) telah disintesis daripada 1 g jumlah RNA menggunakan Kit Transkripsi Balik cDNA kapasiti tinggi (Amersham Biosciences Co., Piscataway, NJ, USA). Penguatan tindak balas rantai polimerase masa nyata (PCR) dilakukan dengan Power SYBR Green Master Mix menggunakan Sistem PCR Masa Nyata 7500 (kedua-duanya daripada Applied Biosystems), mengikut arahan pengeluar. Untuk pengesanan transkrip gen sasaran, kami mereka bentuk primer oligonukleotida ke hadapan dan terbalik secara khusus menggunakan perisian Beacon Designer (PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA, USA). Urutan primer disenaraikan dalam Skim 2. Tahap mRNA sasaran telah dinormalisasi menggunakan glyceraldehyde 3- phosphate dehydrogenase (GAPDH) sebagai kawalan dalaman untuk melayakkan ekspresi relatif mRNA sasaran mengikut kaedah ambang kitaran. Semua sampel dianalisis dalam tiga kali ganda.

Urutan primer untuk penguatan gen yang terlibat dalam mekanisme pembaikan sel dan standard dalaman GAPDH (Skim 2).

Prosedur microarray DNA

Selepas analisis histopatologi, penghibridan microarray telah dilakukan pada sampel hati [20]. Jumlah RNA telah diasingkan daripada tisu hati menggunakan Qiagen RNeasy Midi Kit (Qiagen, Valencia, CA, Amerika Syarikat). Kit pelabelan microarray FairPlay™ (Stratagene, La Jolla, CA, USA) telah digunakan mengikut arahan pengilang. DNA berlabel telah dimuatkan pada cip microarray. Ruang hibridisasi telah dipasang dengan cip microarray, Genom Tikus 230 2.0 Array (Affymetrix Inc., Santa Clara, Amerika Syarikat) dan direndam dalam mandi air semalaman pada 60 darjah . Cip mikroarray telah dibasuh dalam penimbal basuh I, penimbal basuh II, dan kemudian basuh penimbal III selama 5 atau 15 minit. Slaid telah dikeringkan dengan mengempar pada 500 g selama 15 minit dan diimbas dengan Pengimbas Array BMS, menggunakan Array Worx eBiochip Reader (BioRad, Dallas, TX, USA), menggunakan saluran Cy3 dan Cy5 [21].

Analisis jantung tikus terpencil

Tikus jantan Sprague-Dawley seberat 350 ± 50 g telah dibius dengan pentobarbital (100 mg/kg). Vena ekor disuntik dengan heparin (1000 U/kg), dan kemudian trakea diintubasi. Walaupun tikus diventilasi secara mekanikal dengan alat pengudaraan tikus (Model 7025; Ugo Basile, Comerio-Varese, Itali), hati mereka disapu di situ dengan penampan bikarbonat Krebs-Henseleit diubah suai beroksigen oleh kanulasi aorta retrograde. Jantung kemudiannya dipotong dan dipindahkan ke radas Langendorff (Hugo Sachs Electronik, March-Hugstetten, Jerman), di mana ia disapu dengan penimbal bikarbonat Krebs-Henseleit diubah suai beroksigen pada tekanan perfusi malar 75 mmHg. Ventrikel lateks berisi air diperkenalkan melalui vena pulmonari dan disambungkan kepada transduser tekanan Isotec (Hugo Sachs Electronik) untuk mengukur tekanan ventrikel kiri (LVP). Jantung dibenarkan untuk mengimbangi selama 15 minit, pada masa itu tekanan akhir diastolik ventrikel kiri (EDP) diselaraskan kepada 10 mmHg, dan jumlah belon ini dikekalkan sepanjang eksperimen. Kemudian, fungsi kontraktil garis dasar, kadar denyutan jantung, dan aliran koronari (probe aliran elektromagnet extracorporeal; narco Bio-systems, Houston,

TX, Amerika Syarikat) telah diukur. Fungsi kontraktil jantung dikira dengan menolak LVEDP daripada tekanan sistolik puncak LV (LVSP), menghasilkan tekanan maju (LVDP). Selepas penyamaan 1 jam, cincin aorta dirawat dengan kenderaan (salinan) atau CaG (10 ug/ml, 100 ug/ml) 10 minit sebelum pengecutan disebabkan oleh phenylephrine 1 μM. Kemudian, kelonggaran yang bergantung kepada endothelium diinduksi oleh asetilkolin (0.1-100 μM) [22].

Analisis statistik

Min dan ralat piawai bagi semua parameter yang dikaji ditentukan bagi setiap kumpulan menggunakan ujian ANOVA. Ujian-t Pelajar telah dijalankan untuk menentukan perbezaan yang signifikan antara kumpulan kawalan dan dirawat. Nilai p<0.05 was="" considered="">

Keputusan

Perubahan berat badan dan lemak adiposa

Tiada perbezaan yang signifikan dalam berat badan min antara kumpulan rawatan (Rajah 1). Semasa 1-tempoh pentadbiran bulan, berat badan tikus jantan berumur adalah setanding dalam kumpulan kawalan dan CaG-, IQG- dan CS yang dirawat. Purata berat badan mingguan dibentangkan dalam Rajah 2a: CON, 685.16 ± 9.14 g; CaG5, 659.54 ± 14.21 g; IQG5, 646.50 ± 11.56 g dan CS10, 662.93 ± 7.82 g. Kuantiti min lemak perut telah menurun dengan ketara dalam kumpulan IQG5 dan CS10 berbanding kawalan: 21.84 ± 7.46 g untuk kawalan; 20.66 ± 8.47 g untuk CaG5; 16.56 ± 5.97 g untuk IQG5 (IQG5 vs CON, p < 0.05);="" dan="" 16.93="" ±="" 5.17="" g="" untuk="" cs10="" (cs10="" vs="" con,="" p=""><0.05) (rajah="" 2a).="" lemak="" epididimidal="" juga="" berkurangan="" dengan="" ketara="" dalam="" kumpulan="" iqg5="" dan="" cs10="" berbanding="" kawalan:="" 10.38="" ±="" 2.58="" g="" untuk="" kawalan;="" 8.19="" ±="" 4.00="" g="" untuk="" cag5;="" 7.00="" ±="" 1.35="" g="" untuk="">

(IQG5 lwn CON, p < 0.05);="" dan="" 8.56="" ±="" 2.53="" g="" untuk="" cs10="" (cs10="" vs="" con,="" p=""><0.05) (rajah="">

Ketumpatan adiposit

Ketumpatan adiposit [bilangan sel/kawasan (mm2)] tisu hati tikus yang dirawat dengan GAG dalam HFD, seperti yang dinilai oleh pewarnaan toluidine blue O, telah dikurangkan dengan CaG5 (33.00 ± 1.73), IQG5 (45). .00 ± 4.36), atau CS10 (26.00 ± 2.52) (CS10 lwn CON, p < 0.05) jika dibandingkan dengan kawalan (51.00 ± 5.29) (Rajah 2b).

Tekanan darah dan kadar denyutan jantung berubah

Tiada perbezaan ketara dalam tekanan darah (tekanan darah sistolik atau kadar denyutan jantung) diperhatikan antara kumpulan 5 mg/kg CaG-, IQG-, atau CS yang dirawat dan kumpulan kawalan (data tidak ditunjukkan).

Hematologi dan kimia darah

Beberapa perubahan yang bergantung kepada dos diperhatikan di antara kumpulan rawatan dan kawalan berkenaan dengan parameter hematologi yang diperiksa pada akhir eksperimen. Terdapat peningkatan 27.5 peratus dalam APTT (saat) dalam kumpulan5-yang dirawat CaG: CON, 35.68 ± 5.68; CaG5, 45.49 ± 10.91; IQG5, 29.93 ± 3.57; CS10, 36.83 ± 23.95 (Gamb. 3). Masa trombin (saat) adalah seperti berikut: CON, 40.18 ± 2.04; CaG5, 42.13 ± 3.23; IQG5, 36.15 ± 6.67; CS10, 45.02 ± 21.89. Terdapat peningkatan yang ketara (62.6 peratus) dalam Faktor I (fibrinogen, mg/dL) dalam CaG5-kumpulan yang dirawat: CON, 429.33 ± 142.22; CaG5, 698.29 ± 120.28 (CaG5 lwn CON, p < 0.05);="" iqg5,="" 627.14="" ±="" 160.67;="" cs10,="" 790.00="" ±="" 274.22="" (cs10="" lwn="" con,="" p="">< 0.05).="" masa="" protrombin="" (saat)="" adalah="" seperti="" berikut:="" con,="" 62.86="" ±="" 47.30;="" cag5,="" 52.71="" ±="" 4.96;="" iqg5,="" 52.14="" ±="" 5.58;="" cs10,="" 55.00="" ±="">

Biokimia serum

Dalam sera daripada kumpulan yang dirawat IQG dan CS (Jadual 1), paras fosfolipid (mg/dL) adalah jauh lebih rendah daripada sera kawalan selepas 1 bulan dalam tikus berumur: CON, 271.78 ± 91.74; CaG5, 233.67 ± 71.0; IQG5, 173.2 ± 32.{{20}}}2 (IQG5 lwn. CON, p < 0.05);="" cs10,="" 259.7="" ±="" 57.27="" (cs10="" lwn.="" con,="" p="">< 0.05).="" paras="" asid="" lemak="" bebas="" (μeq/l)="" telah="" menurun:="" con,="" 686.78="" ±="" 104.67;="" cag5,="" 431.33="" ±="" 66.22="" (cag5="" lwn.="" con,="" p="">< 0.05);="" iqg5,="" 405.6="" ±="" 63.39="" (iqg5="" lwn.="" con,=""><0.05); cs10,="" 566.9="" ±="" 115.38="" (cs10="" vs.="" con,="" p=""><0.05). also,="" serum="" gpt="" (alt)="" levels="" (iu/l)="" in="" the="" cag-="" and="" iqg-="" treated="" groups="" were="" significantly="" lower="" than="" those="" in="" the="" control="" group="" in="" aged="" rats:="" con,="" 76.33="" ±="" 40.21;="" cag5,="" 36.78="" ±="" 8.0="" iu/l;="" iqg5,="" 43.22="" ±="" 13.86="" (iqg5="" vs.="" con,p="" <="" 0.05);="" cs10,="" 53.44="" ±="" 11.36="" (cs10="" vs.="" con,="" p=""><0.05). fur-="" thermore,="" the="" mean="" creatinine="" phosphokinase="" (ck="" u/l)="" level="" in="" the="" cag-treated="" group="" was="" lower="" than="" that="" in="">

kumpulan kawalan dalam tikus berumur: CON, 125.78 ± 91.66; CaG5, 1{{10}}2.89 ± 65.73 (CaG5 lwn. CON, p < 0.05);="" iqg5,="" 91.22="" ±="" 24.74;="" cs10,="" 131.2="" ±="" 62.56.="" purata="" glukosa="" serum="" (mg/dl)="" telah="" menurun="" dengan="" ketara="" pada="" tikus="" berumur="" (setiap="" kumpulan="" vs="" con,="" p=""><0.05): con,="" 435.11="" ±="" 105.42;="" cag5,="" 304.0="" ±="" 44.44;="" iqg5,="" 275.9="" ±="" 43.18;="" cs10,="" 317.8="" ±="">

Purata paras kolesterol total (mg/dl) dalam kumpulan yang dirawat IQG adalah lebih rendah daripada kumpulan kawalan dalam tikus berumur, dan perbezaan itu juga ketara: CON, 212.67 ± 92.82; CaG5, 181.44 ± 68.4; IQG5, 124.1 ± 23.6 (IQG5 lwn. CON, p < 0.05);="" cs10,="" 198.9="" ±="">

Selain itu, paras trigliserida (mg/dL) adalah seperti berikut: CON, 207.89 ± 101.95; CaG5, 136.22 ± 61.6; IQG5, 103.3 ± 35.59 (IQG5 lwn. CON, p < 0.05);="" cs10,="" 183.4="" ±="" 104.74.="" tahap="" kolesterol="" ldl="" (mg/dl)="" menurun:="" con,="" 74.67="" ±="" 44.91;="" cag5,="" 69.0="" ±="" 31.3;="" iqg5,="" 41.44="" ±="" 10.14="" (iqg5="" lwn.="" con,="" p="">< 0.05);="" cs10,="" 65.22="" ±="" 18.52.="" penurunan="" paras="" asid="" urik="" yang="" ketara="" (mg/dl)="" dilihat="" dalam="" semua="" kumpulan="" yang="" dirawat="" gag="" berbanding="" dengan="" kawalan="" (setiap="" kumpulan="" berbanding="" con,="" p=""><0.05): con,="" 10.9="" ±="" 2.26;="" cag5,="" 8.12="" ±="" 1.48;="" iqg5,="" 6.49="" ±="" 0.89;="" cs10,="" 8.14="" ±="" 2.17,="" jadual="">

Pengurangan kerosakan oksidatif

Malondialdehid (MDA, nmol/ml) telah diuji selepas 1 bulan setiap rawatan GAG [CON, 252.9 ± 13.1; CaG5, 175.1 ± 5.8 (30.32 peratus menurun). Setiap rawatan GAG dan kondroitin sulfat mengurangkan peroksidasi lipid dalam hepatosit (Rajah 4a). Kepekatan karbonil protein dalam darah telah menurun pada nisbah 68.52 peratus, 36.89 peratus dan 53.70 peratus dalam GaG5, IQG5 dan CS10, masing-masing (Rajah 4b). Tetapi, setiap GAG tidak mempunyai perbezaan statistik berbanding dengan kawalan dalam kandungan carbonyl hepatosit (data tidak ditunjukkan).

Kuantiti enzim oksidatif (katalase, GPx, GST, SOD).

Aktiviti katalase (mg protein/min) dalam hepatosit selepas 1 bulan rawatan GAG adalah seperti berikut: CON, 17.72 ± 2.81; CaG5, 19.87 ± 3.88; IQG5, 17.22 ± 4.55; CS10, 19.23 ± 3.55. Aktiviti katalase dalam semua kumpulan hepatosit yang dirawat CaG meningkat. Super oksida dismutase (SOD) ialah enzim penghapus radikal bebas (super oksida). Aktiviti SOD (nmol/min/ml) meningkat dalam kumpulan rawatan berbanding dengan kawalan: kawalan, 381.44 ± 85.32; CaG5, 400.56 ± 60.62; IQG5, 386.72 ± 69.22; CS10, 513.05 ± 60.07. Aktiviti glutathione peroksidase (unit/mg protein) dalam kumpulan hepatosit yang dirawat CaG telah meningkat dengan ketara oleh rawatan (CaG5 vs. CON, p <0.05), dan="" aktiviti="" glutathione="" s-transferase="" (nmol/min/ml)="" dalam="" kumpulan="" cag="" juga="" meningkat="" dengan="" ketara="" berbanding="" kumpulan="" kawalan="" (cag5="" vs.="" con,="" p=""><0.05) (jadual="">

Pengeluaran IL-1 dan IL-10 sitokin

Peningkatan tahap IL-10 diperhatikan dalam kumpulan yang dirawat CaG. Tahap IL-1 (ρg/ml) dalam serum telah dikurangkan sebanyak 1

Jadual 1 Penemuan serologi tikus tua yang dirawat dengan CaG atau IQG selama 1 bulan

bulan rawatan CaG atau IQG, menunjukkan tindakan anti-radang kompaun: kawalan, 251.3 ± 70.7; CaG5, 102.9 ± 9.5; IQG5, 110.4 ± 5.2; CS10, 110.4 ± 10.1 (setiap kumpulan lwn. CON, p < 0.05).="" aktiviti="" il-10="" (ρg/ml)="" selepas="" 1="" bulan="" rawatan="" cag="" dalam="" tikus="" telah="" meningkat:="" con,="" 34.9="" ±="" 11.5;="" cag5,="" 67.4="" ±="" 13.3="" (cag5="" lwn.="" con,=""><0.05); iqg5,="" 55.5="" ±="" 24.7;="" cs10,="" 28.0="" ±="" 3.8="" (fig.="" 5).="" the="" il-10="" levels="" in="" the="" cs10="" group,="" was="" statistically="" different="" from="" that="" in="" the="" con="" group="" (cs10="" vs.="" con,p=""><>

Ekspresi gen oleh analisis PCR masa nyata kuantitatif

The data represented that PCR cycle required number (Ct value) when the concentration of PCR amplicon are equilibrated by sample amplicon. Median CT values of 5 sample's represented, but there was no difference from the control group (Ct vale >2.0) pada jujukan primer terpakai (data tidak ditunjukkan).

Mikroarray DNA

Analisis mikroarray menggunakan tatasusunan klon cDNA Mouse 28 K telah dilakukan untuk mengenal pasti profil ekspresi gen dalam CaG, IQG dan hati tikus SD berusia 15- bulan yang dirawat dengan CS, dan untuk memberikan maklumat tentang potensianti penuaanpenanda.

Berbanding dengan kumpulan kawalan, kumpulan CaG5 mempamerkan peningkatan 2- hingga 4-lipat ganda dalam 118 gen, 4- 8-pertambahan kali ganda dalam 11 gen dan lebih besar daripada 8-kali ganda peningkatan dalam 2 gen. Tahap ekspresi baki ~30,000 gen kekal sama. Enam puluh gen telah dikurangkan daripada 2- kepada 4-lipatan dan 4 menunjukkan penurunan 4- kepada 8-lipat ganda.

Dalam kumpulan IQG5 berbanding kumpulan kawalan, 162 gen meningkat sebanyak 2- kepada 4-kali ganda, 10 gen meningkat sebanyak 4- kepada 8-kali ganda, dan 3 gen meningkat sebanyak lebih daripada 8- kali ganda. Sebaliknya, 66 telah dikurangkan oleh 2- kepada 4-lipat dan 7 dikurangkan sebanyak 4- kepada 8-lipat.

Jadual 2 Aktiviti enzim antioksidan kumbang tahi glikosaminoglikan dalam hati tikus tua

Dalam kumpulan CS10 berbanding dengan kumpulan kawalan 63 gen telah dikawal oleh 2- kepada 4-lipat ganda, 2 gen meningkat sebanyak 4- kepada 8-kali ganda, dan 2 gen telah dikawal selia lebih daripada 8- kali ganda. Tiga puluh lapan gen telah dikurangkan sebanyak 2- kepada 4-lipat ganda, 4 diturunkan sebanyak 4- kepada 8-kali ganda dan 4 menurun lebih daripada 8-kali ganda.

Jika dibandingkan dengan kumpulan kawalan, gen lipocalin2 (Lcn2) meningkat kira-kira 10-kali ganda dalam CaG5- tisu hati yang dirawat, 46-kali ganda dalam kumpulan IQ5 dan {{6} }lipat dalam kumpulan CS10. Dalam tisu hati tikus yang dirawat CaG5-, lysil oxidase (Lox) dikurangkan pada nisbah 0.13, iaitu, ekspresi gen dikurangkan. Kumpulan tikus yang dirawat CaG5, berbanding dengan kawalan, menunjukkan bahawa 131 gen termasuk lipocalin 2, protein pengikat oligosakarida (Lbp), dan perencat peptidase serine, Kaszal type3 (Spink3) telah dikawal (Jadual 3) dan 64 gen termasuk lysyl oxidase (Lox), serine dehydratase (sds) dan retinol tepu (Retreat) dikawal ke bawah (Jadual 4). Kumpulan yang dirawat CaG5-, berbanding kumpulan kawalan, mempamerkan pengawalseliaan 131 gen, termasuk lipocalin 2, protein pengikat oligosakarida (Lbp) dan perencat peptidase serin Kaszal jenis 3 (Spink3) (Jadual 3 ) dan downregulation 64 gen, termasuk lysyl oxidase (Lox), serine dehydratase (sds), dan retinol saturate (Retsat) (Jadual 4). Data ini menunjuk kepada lipocalin 2 dan adipokin, sebagai gen terkawal, dan lysyl oxidase (berkaitan dengan heparanase), sebagai gen terkawal, sebagai penanda terapeutik berpotensi yang berfungsi menentang penuaan dan obesiti

Pencirian CaG

Komposisi monosakarida amino, berasid, dan neutral GaG ditentukan oleh GC-MS (Jadual 5). Monosakarida amino utama CaG adalah dalam susunan berikut: D-glucosaminic acid > N-asetil-galactosa- mine > N-asetil-D-gactosaminitol > galactosamine HCl > galactosaminic acid > galactosamine > glucuronic acid. Juga, monosakarida neutral yang terdapat dalam CaG adalah terutamanya - glukosa dan manitol, manakala yang kecil termasuk arabinosa dan rhamnose.

Petunjuk perlindungan kardio

Dalam eksperimen ini, kami mencirikan kesan langsung CaG pada arteri rintangan menggunakan vesel yang diinkubasi secara in vitro dengan penguncupan yang disebabkan oleh fenilefrin dan kelonggaran yang disebabkan oleh asetilkolin. CaG dinilai sebagai agen kardioprotektif. Keluk tindak balas kepekatan kepada CaG telah dianjak ke bawah berbanding yang dilihat selepas rawatan kawalan (PBS sahaja), menunjukkan bahawa rangsangan jantung berlaku dalam cara yang bergantung kepada kepekatan (Rajah 6).

Perbincangan

Penuaan adalah proses penurunan progresif dalam kapasiti fisiologi-logik organisma, yang ditunjukkan oleh perubahan terkumpul dan ketidakstabilan di peringkat keseluruhan sistem [13]. Glycosaminoglycan dianggap dapat mengurangkan kesan buruk penuaan dengan menghalang pemusnahan rawan, tulang, cakera, kulit [23], sistem vaskular [8], dll. Baru-baru ini, Sejenis GAG sebagai bahan pelbagai fungsi, poliuretana asas heparin atau adalah dianggap pada masa ini sebagai salah satu biokompatibel dan serasi darah yang telah ditetapkan

biomaterial yang menawarkan hubungan struktur-sifat yang hebat seperti imobilisasi heparin pada cantuman poliuretana diubah suai kitosan dengan sifat anti-pelekat dan antimikrob [24]. Pada masa kini, kemunculan kawalan suhu telah memungkinkan reka bentuk sistem pemeliharaan serangga berskala besar. Oleh itu, glikosaminoglikan

boleh diperolehi daripada korteks serangga sebagai sisa ekstrak alkohol. Dadah mentah seperti kumbang tahi dan ratu B. ignitus telah dikaji dalam usaha untuk mengenal pasti komponen aktifnya atau menjadikan ekstrak lebih selamat untuk kegunaan manusia. Kumbang tahi C. molossus telah ditulenkan untuk menghasilkan dimer N-asetil-dopamin, molossusamide AC (1–3), menunjukkan

Aktiviti perencatan COX-1 dan COX-2 [25]; kitosan [26]; melanin [27]; dan protease serin [9, 28]. Ekstrak lebah (Bombus ignitus) telah ditunjukkan mengandungi racun lebah serine protease [29], peroxiredoxins [30], dan protein pengiktirafan peptidoglycan (PGRP-S) [31].

Strategi untuk mencegah atau melambatkan penuaan termasuk pengambilan antioksidan untuk membaiki kerosakan sel oksidatif kepada DNA, protein, dan lipid, serta penjanaan semula tisu pengantara sel stem dan terapi gen [32]. Sebagai penanda kerosakan oksidatif lipid dalam keadaan tekanan oksidatif lipid hepatosit, malondialdehid dikurangkan dengan rawatan CaG. Selain itu, kandungan karbonil dalam darah, terutamanya neutrofil, telah dikurangkan dengan rawatan CAG dan menunjukkan membaiki kerosakan protein oksidatif selular.

Glycosaminoglycans daripada C. molossus dan B. ignitus queens terdiri terutamanya daripada asid D-glucosaminic sebagai monosakarida berasid dan N-asetil-galactosaminitol sebagai amino

monosakarida, bersama-sama dengan -glukosa dan D-manitol sebagai monosakarida neutral. Oleh itu, sebatian itu boleh mengakses reseptor membran sel dan boleh mencegah punca penyakit berkaitan usia dengan mengubah metabolisme tenaga. Glikosaminoglikan boleh membaiki tisu penghubung [23], terhakis rawan, cakera, tulang, dan glikoprotein pada tahap molekul, dengan GAG membentuk ikatan antara protein [9]. Dalam eksperimen ini, tikus yang digunakan adalah tua dan beratnya kira-kira 680 g, jadi, tidak mudah untuk mengurangkan berat badan, tetapi kami memerhatikan penurunan berat lemak adipos dan bilangan adiposit. Seperti kebanyakan glycosaminoglycans, CaG dan IQG membawa pengurangan paras serum parameter berkaitan keradangan: asid lemak bebas, AST (SGPT), kreatinin kinase (fungsi jantung yang berkaitan), glukosa, asid urik dan hiperglikemia berkaitan tahap: kolesterol, jumlah, trigliserida, kolesterol LDL, dsb. Paras asid lemak bebas (hati berlemak yang berkaitan) bagi kumpulan yang dirawat secara statistik menurun dengan ketara, 36.7 peratus dalam kumpulan CaG dan 40.94 peratus dalam kumpulan IQG. Juga, tahap sGPT (fungsi hati yang berkaitan) telah dikurangkan dengan ketara, 51.58 peratus dalam kumpulan CaG dan 43.38 peratus dalam kumpulan IQG.

Data yang dijana daripada analisis microarray DNA menyokonganti penuaankesan IQG, dengan perubahan bermakna dalam profil ekspresi gen dalam 14-tikus SD berumur sebulan yang diperhatikan selepas 1-tempoh rawatan sebulan. Tikus yang dirawat CaG5-, berbanding kumpulan kawalan, mempunyai peningkatan dalam 131 gen, termasuk lipocalin 2 [33], protein pengikat lipo-sakarida (Lbp) [34] dan perencat serine peptidase, Kazal type3 (Spink3) [35] dan berkurangan dalam 64 gen, termasuk lysyl oxidase (Lox) [36], serine dehydratase (sds) [37], dan retinol saturase (Retsat) [38]. Data menunjuk kepada lipocalin 2 dan adipokin, yang dikawal selia, dan lysyl oxidase (berkaitan dengan heparanase), yang dikawal ke bawah, sebagai penanda terapeutik yang berpotensi untukanti penuaankesan pada haiwan obes.

Kajian ini memerhatikan perubahan bermakna dalam profil ekspresi gen dalam tikus berumur selepas rawatan dengan CaG atau IQG selama 1 bulan. Ekspresi gen lipocalin-2, yang merupakan adipokin yang terlibat dalam rintangan insulin [39] dan protein rembesan dengan kemakmuran pengikat lipid, telah meningkat kira-kira 10 kali ganda. Ini adalah selaras dengan kajian microarray yang melaporkan bahawa pengambilan kacang soya menyebabkan peningkatan amiloid- pendamping endogen, jenis lipocalin prostaglandin D2 synthase (Ptgds), yang membawa kepada penindasan amiloid dan mencegah disfungsi kognitif [4{{ 22}}]. Protein pengikat lipopolysaccharide (LPS) (LBP), penanda pengganti translokasi mikrob, dikaitkan dengan penurunan fungsi fizikal dan peningkatan keradangan [41]. Proses penuaan normal mengubah sistem pembekuan darah pada manusia; Antikoagulan semulajadi, termasuk antitrombin III, kofaktor heparin II, protein C, protein S, dan perencat laluan faktor tisu, boleh memodulasi tindak balas sistem pembekuan darah [42]. Dalam kajian ini, terdapat peningkatan yang ketara dalam faktor I (fibrinogen) dalam CaG (162.6 peratus), IQG (146.0 peratus), dan CS10 (184.0 peratus) - kumpulan yang dirawat jika dibandingkan dengan kumpulan kawalan, yang dirawat PBS. Juga, tahap LBP (protein pengikat LPS) telah dikawal selia dalam data microarray DNA kami, menunjukkan bahawa heparin (GAG) mengikat LBP, memudahkan pemindahan LPS ke CD14, dan meningkatkan pengaktifan monosit darah periferi yang dimediasi LPS, mengakibatkan aktiviti antikoagulan [43]. Perencat trypsin, perencat protease serin Kazal-jenis 3 (Spink3), telah dikawal selia dalam eksperimen ini, menunjukkan peranan untuk modulasi paracrine; ia juga terlibat dalam implantasi embrio [44]. Oleh kerana Spink3 adalah perencat protease serine yang penting, pengawalseliaannya mungkin mencerminkan mekanisme sitoprotektif endogen yang penting yang akan menghalang kecederaan selanjutnya [45]. Pengurangan lysyl oxidase mungkin menunjukkan bahawa heparin (GAG) yang menghalang pengikatan ketat lysyl oxidase kepada fibril yang telah terbentuk hampir tidak terjejas [46]. Penurunan regulasi tepu retinol yang dilihat dalam eksperimen ini adalah ketara, kerana saturasi retinol menggalakkan adipogenesis dan dikurangkan dalam obesiti [47]. Menurut hipotesis, ketumpatan tisu adiposa, biomarker baru yang meramalkan risiko kematian pada orang dewasa yang lebih tua yang nampaknya tidak berkaitan dengan keradangan [48], selain itu, CaG mengurangkan ketumpatan adiposa dengan ketara menjanjikan kesan yang kuat.anti penuaanejen.

Kesimpulan

Glikosaminoglycan kumbang tahi menurunkan paras kolesterol dan trigliserida dalam serum, menyebabkan penurunan berat tisu adiposa dan normalisasi paras serum asid lemak bebas, GPT, glukosa, dan asid urik, dan pemanjangan masa pembekuan yang akan menghalang pengagregatan darah dan lipid pengumpulan dalam halangan endothelial vaskular yang menyumbang kepada homeostasis dalam sistem peredaran darah. IL{{0}} (pg/ml) dalam serum telah dikurangkan sebanyak 1 bulan rawatan CaG atau IQG, yang menunjukkan tindakan anti-radang. Di samping itu, lipocalin gen pelindung hati sangat terkawal (10-}kali ganda) dan lysyl oxidase dikurangkan (0.1-}kali ganda) dalam tikus yang dirawat CaG. CaG yang diperoleh daripada serangga boleh menjadi a

penggantian yang lebih selamat untuk heparin dan GAG lain daripada sumber mamalia, kerana sumber serangga mengurangkan kemungkinan penularan virus berjangkit daripada haiwan seperti babi. Keputusan ini menunjukkan bahawa CaG dan BIQ bukan sahaja semulajadianti penuaanagen tetapi juga merupakan makanan berfungsi, sama dengan kitosan dan biomaterial masa hadapan yang memainkan peranan penting dalam kehidupan kita hari ini.

Singkatan

ALP: Fosfatase alkali; ALT(GPT): Glutamat piruvat transaminase; aPTT: Masa tromboplastin separa diaktifkan; AST(GOT): Glutamat oksaloasetat transaminase; BUN: Nitrogen urea darah; CaG 5: Kumbang tahi (Catharsius molossus) glikosaminoglikan 5 mg/kg; CK: Kreatinin fosfokinase; CON: Kumpulan kawalan; CRP: protein C-reaktif;

CS10: Kondroitin sulfat (10 mg/kg); GAG: Glycosaminoglycan; GGT: - glutamyl transferase; H. Chol: Kolesterol tinggi; IQG5: Ratu Bombus ignitus (sejenis lebah) glikosaminoglikan 5 mg/kg; l.Chol: Kolestrol rendah; LDH: Laktat dehidrogenase; PT: Masa prothrombin; T. Chol: Jumlah kolesterol; TG: Trigliserida

Ucapan terima kasih

Penulis mengiktiraf Akademi Sains Pertanian Kebangsaan untuk kewangan (RDA, PJ011853) dan sokongan teknikal.

Pembiayaan

Kerja ini disokong oleh projek Penyelidikan Asas Pentadbiran Pembangunan Luar Bandar, PJ011853.

Ketersediaan data dan bahan

Semua data tersedia di portal Jurnal dalam manuskrip yang diserahkan. Tiada fail/data sokongan lain diperlukan bersama-sama dengan penyerahan ini.

Kepentingan yang bersaing

Penulis mengisytiharkan bahawa mereka tidak mempunyai kepentingan bersaing.

Sumbangan penulis

MY melakukan kebanyakan eksperimen, menyediakan manuskrip: memahami kajian, mengambil bahagian dalam reka bentuk dan penyelarasannya, mengumpul dan menganalisis data, dan menyediakan manuskrip. BJ menjalankan kajian haiwan, mengambil bahagian dalam ujian enzim berkaitan oksidatif. HJ menjalankan ujian sitokin. JS mengambil bahagian dalam penjajaran urutan genetik. KK mengambil bahagian dalam microarray DNA. YS menjalankan kajian in vivo tentang tindak balas arteri rintangan. Semua pengarang membaca dan meluluskan manuskrip akhir.

Persetujuan untuk penerbitan

Manuskrip ini tidak mengandungi data individu dalam sebarang bentuk.

Kelulusan etika

Kajian yang melibatkan haiwan telah diluluskan oleh Jawatankuasa Etika Haiwan Makmal Akademi Sains Pertanian Kebangsaan, RDA, Korea Selatan (NAAS1503).

Manuskrip yang melaporkan kajian tidak mengandungi peserta manusia, data manusia atau tisu manusia.

Nota Penerbit

Springer Nature kekal berkecuali berkenaan dengan tuntutan bidang kuasa dalam peta yang diterbitkan dan gabungan institusi.

Butiran pengarang

1Jabatan Biologi Pertanian, Akademi Sains Pertanian Kebangsaan, Pentadbiran Pembangunan Luar Bandar (RDA), Wanju-Gun 55365, Korea Selatan. 2Kolej Farmasi, Universiti Ajou, Suwon 442-749, Korea Selatan. 3Pharmacogenechips Inc., Chuncheon 200-160, Korea Selatan.