Analisis Ekspresi MicroRNA Selepas Intervensi Glutamin dalam Kecederaan Iskemia-Reperfusi Renal Akut

Latar belakang.Iskemia-reperfusikecederaan buah pinggang akut(I/R AKI) ialah apenyakit buah pinggang yang terukdengan mortaliti dan morbiditi yang tinggi. Kajian ini bertujuan untuk menerokamekanisme perlindungan glutamin(GLN) terhadap I/R AKI.Kaedah. The model tikus I/R AKI telah ditubuhkan, dan HEpewarnaan tisu buah pinggang dan kreatinin serum(SCr) dan pengesanan nitrogen urea darah (BUN) telah dilakukan. MiRNA telah dijujukan oleh pemprosesan tinggi dalamsampel tisu buah pinggang tikus. MiRNA yang dinyatakan secara berbeza (DEmiRs) antara kumpulan I / R dan kumpulan I / R + GLN telah disaring, dan analisis pengayaan untuk gen sasaran DEmiRs telah dilakukan. Sementara itu, sel HK-2 manusia telah dikultur dan model I/R telah ditubuhkan untuk mengesahkan ungkapan DEmiR.Keputusan.Berbanding dengan kumpulan I/R, tahap SCr dan BUN pada setiap titik masa adalah lebih rendah dalam kumpulan I/R + GLN. Kemerosotan vakuolar tubul renal dalam kumpulan I/R + GLN dikurangkan dengan ketara. Dalam 104 DEmiR, kami memilih miR-132-5p, miR- 205 dan miR-615 sebagai miRNA utama. Analisis KEGG menunjukkan bahawa laluan isyarat Notch, laluan isyarat PI3K-Akt, dan laluan isyarat cGMP adalah berkaitan terutamanya dengan GLN terhadap I/R. qRT-PCR mengesahkan penurunan peraturan miR-205 dalam kumpulan I/R, berbanding kumpulan palsu dan I/R kumpulan GLN. Model I/R telah diwujudkan dengan sel HK-2 dan ungkapan miR- 132-5p dan miR-205 telah dikurangkan.

Kesimpulan.GLN mengurangkan AKI yang disebabkan oleh I/R. Terdapat perbezaan yang signifikan antara ekspresi miRNA dalam I / R selepas rawatan GLN. Proses GLN terhadap AKI yang disebabkan oleh I/R mungkin berkaitan dengan laluan isyarat Notch dan PI3K-Akt.

EKSTRAK CISTANCHE DENGAN 25% ECHINACOSIDE DAN 9% ACTEOSIDE UNTUK BUAH PINGGANG

1. Pengenalan

Kecederaan buah pinggang akut(AKI) dicirikan olehfungsi buah pinggang akutkerugian dan menjejaskan 13.3 juta orang setiap tahun [1]. Antara pelbagai faktor, buah pinggangkecederaan iskemia-reperfusi(I/R) adalah salah satu punca asas AKI dan masalah yang tidak dapat dielakkan dalampemindahan buah pinggang[2, 3]. AKI berkaitan I/R dikaitkan dengan morbiditi dan kematian yang tinggi dan pada masa ini tidak mempunyai rawatan yang berkesan [4].

Dalam amalan klinikal, AKI dimanifestasikan oleh pengumpulan produk akhir metabolisme nitrogen (urea dan kreatinin) dan penurunan pengeluaran air kencing [5]. Di samping itu, terdapat kerosakan serentak pada sel epitelium tubular renal dan saluran darah dan tindak balas keradangan yang kuat [6, 7]. Kajian terbaru mendapati bahawa glutamin, ubat yang digunakan sebagai terapi pemakanan konvensional untuk AKI, boleh melindungi buah pinggang dengan mengurangkan tekanan oksidatif [8, 9]. Di bawah keadaan fisiologi tertentu, glutamin digunakan secara meluas sebagai bahan api metabolik utama untuk buah pinggang dan sistem imun [10, 11]. Walau bagaimanapun, mekanisme perlindungan khususnya masih dalam kajian.

microRNAs (miRNAs), molekul kecil yang sangat terpelihara sebanyak 21-25 nukleotida, telah dilaporkan dikaitkan dengan I / R dan AKI buah pinggang [12, 13]. miRNA boleh memainkan peranan perlindungan dalam I/R buah pinggang dengan melemahkantindak balas keradangan[14]. Walaupun kesan perlindungan beberapa miRNA pada IRI buah pinggang telah ditemui, mekanisme perlindungan masih tidak jelas.

Setakat ini, beberapa kajian telah dijalankan mengenai mekanismeperlindungan buah pinggang pengantara glutaminpada tahap miRNA. Dalam kajian ini, kami menggunakan teknik penjujukan throughput tinggi untuk menganalisis ekspresi pembezaan miRNA dalam I / R buah pinggang selepas campur tangan glutamin. Kami selanjutnya meneroka mekanisme perlindungan glutamin terhadap I / R buah pinggang pada tahap miRNA.

2. Bahan-bahan dan cara-cara

2.1. Haiwan Eksperimen.

Sebanyak 72 ekor tikus jantan Sprague Dawley (SD) SPF, seberat 180–260 g dan berumur 90–120 hari, telah disediakan oleh Pusat Haiwan Eksperimen Hospital Gabungan Pertama Universiti Perubatan Xinjiang. Tikus disimpan dalam persekitaran suhu malar dengan catuan harian eksperimen yang standard tanpa mengawal pengambilan air. +ey telah sama-sama rawak kepada tiga kumpulan: kumpulan palsu, kumpulan I/R dan kumpulan I/R + GLN. +e protokol eksperimen telah diluluskan oleh Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan di +e Hospital Gabungan Pertama Universiti Perubatan Xinjiang.

2.2. Penubuhan Model Haiwan.

Tikus SD telah dibius dengan suntikan intraperitoneal 2% natrium pentobarbital (40 mg/kg). Kumpulan I/R: hirisan perut garis tengah dibuat dan kedua-dua buah pinggang terdedah, buah pinggang kanan direseksi, dan arteri buah pinggang kiri diapit. Selepas 45 minit, pengapit vaskular dikeluarkan. +e warna buah pinggang bertukar daripada merah gelap kepada merah terang, membayangkan bahawa kanak-kanak menjalani proses patofisiologi I/R, tikus diperhatikan selama 2 jam selepas menutup rongga perut. NS dan glutamin (0.75 g/kg) masing-masing disuntik dengan menggunakan pam mikro daripada vena ekor pada kadar 0.5 ml/min selepas pemodelan selesai. Kumpulan Syam: buah pinggang kanan direseksi dengan cara yang sama, dan pedikel buah pinggang kiri tidak diapit. Normal saline (NS) disuntik dengan menggunakan pam mikro dari vena ekor pada kadar 0.5 ml/min selepas pemodelan selesai.

2.3. Pengumpulan dan Pengujian Spesimen.

Enam tikus dari setiap kumpulan dipilih secara rawak pada setiap titik masa (1 jam, 5 jam, 12 jam, dan 24 jam selepas pemodelan), dan kemudian, tikus dibunuh di bawah bius. +e aorta abdomen terdedah, dan darah vena dikumpulkan dengan picagari. Serum diasingkan secara rutin dan disimpan di dalam peti sejuk pada suhu -80 darjah . +e buah pinggang dengan cepat direseksi, dan kemudian, satu keping tisu diambil daripada buah pinggang dua hala untuk diletakkan dalam 10% formaldehid neutral dan difikatkan semalaman pada 4 darjah . Kreatinin serum (SCr) dan nitrogen urea darah (BUN) telah diuji dengan Penganalisis Biokimia Automatik Beckman. Blok parafin disediakan daripada tisu buah pinggang tetap melalui proses dehidrasi, ketelusan, impregnasi lilin, dan dehidrasi terbenam. Blok parafin kemudiannya dipotong menjadi beberapa bahagian, dan pewarnaan dilakukan.

2.4. Analisis Penjujukan Prestasi Tinggi.

Jumlah RNA sampel tisu buah pinggang tikus daripada kumpulan I/R dan kumpulan I/R + GLN telah diekstrak dan dinilai untuk kualitinya. Mengikut proses pembinaan perpustakaan penjujukan RNA kecil, jumlah RNA tisu buah pinggang yang telah disucikan telah ditranskripsikan secara terbalik ke dalam cDNA. +en, penguatan PCR, penulenan dan pengesanan kualiti perpustakaan cDNA telah dilakukan untuk menyelesaikan pembinaan perpustakaan sampel penjujukan. Kemudian, kami memperoleh data fail FASTQ asal.

2.5. Analisis Bioinformatik.

Clean reads were classified and annotated from the FASTQ file. +e Rfam database, species reference transcripts, and repetitive sequence database were used to analyze the known miRNA annotations, miRNA prediction, and miRNA quantification. +e differentially expressed miRNAs (DEmiRs) were analyzed using the DESeq R package with |log2FoldChange|>2 dan P < 0.05. +e ramalan gen sasaran dilakukan menggunakan pangkalan data RAID dan miRanda, masing-masing. Analisis pengayaan laluan Gene Ontology (GO) dan KEGG juga dilakukan untuk gen sasaran menggunakan pakej ClusterProfiler R. P <0.05 dianggap sebagai pengayaan yang signifikan.

2.6. Tindak balas Rantaian Polimerase Masa Nyata Kuantitatif (qRT-PCR).

Spesimen dikumpul daripadatisu buah pinggang tikus24 jam selepas pemodelan. Jumlah RNA telah diekstrak, dan produk cDNA semua miRNA diperoleh menggunakan kit sintesis cDNA untai pertama miRNA (Shenggong, Shanghai, China). Pengesanan kuantitatif pendarfluor dilakukan menggunakan kit PCR kuantitatif pendarfluor miRNA (Shenggong, Shanghai, China) dengan 3 primer khusus miRNA (Jadual 1). +e kaedah analisis kuantitatif relatif (2−ΔΔCt) digunakan untuk mengira ungkapan relatif miRNA sasaran dalam setiap kumpulan sampel. +e ungkapan relatif miRNA dalam setiap kumpulan dikira menggunakan ungkapan U6 dalam setiap sampel dalam setiap kumpulan sebagai rujukan.

2.7. Analisis statistik.

Data telah dianalisis oleh SPSS19.0. Semua data dinyatakan sebagai min ± sisihan piawai (min ± SD). +e ujian-t digunakan untuk perbandingan berpasangan antara kumpulan. P < 0.05 menunjukkan bahawa perbezaan adalah signifikan secara statistik.

3. Keputusan

3.1. Kesan Glutamin pada Fungsi Buah Pinggang Tikus selepas Iskemia-Reperfusi.

Tahap SCr dan BUN pertama kali diperiksa dalam tiga kumpulan tikus (Rajah 1(a) dan 1(b)). +e SCr dan BUN terus meningkat daripada 1 hingga 24 jam, mencapai puncak pada 24 jam dalam kumpulan I/R, yang jauh lebih tinggi daripada kumpulan palsu (P < 0.{{11} }5). Dalam kumpulan I/R + GLN, tahap SCr dan BUN dinaikkan daripada 1 jam kepada 12 jam, tetapi aliran meningkat adalah lebih perlahan daripada kumpulan I/R. Tahap SCr dan BUN pada setiap titik masa adalah lebih rendah daripada kumpulan I/R (P <0.05).

3.2. Perubahan Histologi dalam Buah Pinggang Tikus.

Dalam kumpulan palsu, selepas 24 jam pembedahan, pemerhatian mikroskopik mendedahkan bahawa beberapa tubul renal di kawasan korteks telah diluaskan, dan beberapa epithelia tubul renal menunjukkan edema dan degenerasi vakuolar, dan tidak ada kelainan yang jelas dalam glomeruli (Rajah 2(a). )). Dalam kumpulan I/R, sempadan berus tubul renal di kawasan kortikal dan kawasan peralihan korteks-medullari hilang, sejumlah besar sel epitelium tiub renal menunjukkan edema dan degenerasi vakuolar, manakala sebahagian daripadanya menunjukkan karyopyknosis, noda merah sitoplasma, nekrosis pembekuan, absisi, dan pembentukan tuang

Rajah 1: Perubahan tahap Scr (a) dan BUN (b) tikus pada titik masa yang berbeza dalam setiap kumpulan. ∗P < 0.05 berbanding dengan kumpulan palsu; #P <0.05 berbanding dengan kumpulan I/R

Rajah 2: Perubahan histopatologi buah pinggang tikus yang dikesan oleh pewarnaan HE. (a) Kumpulan Sham, (b) kumpulan I/R, dan (c) kumpulan I/R + GLN. Bar: 200×.

(Rajah 2(b)). Tiada tanda keradangan dalam interstitium, dan tiada kelainan yang jelas kelihatan pada glomeruli. Dalam kumpulan I/R + GLN, struktur glomerulus adalah normal di bawah mikroskop, beberapa sel epitelium tiub membengkak dan menunjukkan degenerasi belon, beberapa sel epitelium tiub telah dihilangkan, beberapa tubul diluaskan, dan sejumlah kecil tuangan protein ditemui. (Rajah 2(c)).

3.3. Pengenalpastian miRNA yang Diungkapkan Secara Berbeza.

Analisis statistik dilakukan pada miRNA yang dinyatakan secara berbeza yang disaring daripada kumpulan I / R dan kumpulan I / R + GLN. Berbanding dengan kumpulan I / R + GLN, sejumlah 104 miRNA yang dinyatakan secara signifikan telah disaring dalam kumpulan I / R (Rajah 3 (a)). Antaranya, 76 menyatakan miRNA terkawal, dan 28 menyatakan miRNA terkawal (Rajah 3(b)). Di samping itu, RAID dan Miranda digunakan untuk melakukan ramalan gen sasaran untuk miRNA yang dinyatakan secara ketara. Kami mendapati 436 gen sasaran persimpangan (Rajah 3(c)). +en, kami membina rangkaian pengawalseliaan gen sasaran miRNA (Rajah S1). Yang penting, kami memilih miR{11}}p, miR{12}} dan miR{13}} yang dikurangkan dalam kumpulan I/R sebagai miRNA utama untuk kajian lanjut. Juga, terdapat 65 gen sasaran untuk ketiga-tiga miRNA ini (Rajah 3(d)). Menurut keputusan pengesanan qRT-PCR dalam tisu buah pinggang, tahap ekspresi miR-132-5p, miR-205 dan miR-615 telah menurun dalam kumpulan I/R (Rajah 4 ).

3.4. Fungsi Biologi Gen Sasaran.

Untuk mengenal pasti mekanisme molekul yang mendasari kesan terapeutik GLN, kami melakukan analisis pengayaan untuk gen sasaran. Dalam keputusan GO (Rajah 5(a)), transduksi isyarat intraselular, pengawalseliaan percambahan sel stem, dan tindak balas selular terhadap hipoksia proses biologi (BP) telah diperkaya oleh gen sasaran. Tambahan pula, laluan isyarat Notch, laluan isyarat PI3K-Akt, dan laluan isyarat cGMP PKG bagi laluan KEGG telah diperkaya dengan ketara (Rajah 5(b)). Menariknya, rno-miR-132-5p mengambil bahagian dalam laluan cGMP-PKG dengan menyasarkan Mylk.

Perkhidmatan Sokongan Wecistanche-Pengeksport cistanche terbesar di China:

E-mel:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Beli Untuk Butiran Spesifikasi Lebih Lanjut:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

DAPATKAN EKSTRAK CISTANCHE ORGANIK SEMULAJADI DENGAN 25% ECHINACOSIDE DAN 9% ACTEOSIDE UNTUK JANGKITAN BUAH PINGGANG