Perubahan dalam Terjemahan Protein Dan Proses Katabolik Asid Karboksilik dalam Penyakit Buah Pinggang Diabetik

Abstrak: Penyakit buah pinggang kencing manis (DKD)kekal sebagai punca utamapenyakit buah pinggang peringkat akhirwalaupun berpuluh tahun belajar. Perubahan dalamglomerulus dan tubul buah pinggangkedua-duanya menyumbang kepadapatogenesis DKDwalaupun majoriti usaha penyiasatan tertumpu pada glomerulus. Kami berusaha untuk memeriksa tandatangan ekspresi pembezaan DKD manusia dalam glomerulus dan tubul proksimal dan menyokong penemuan kami dalam model tetikus db / db diabetes. Analisis rangkaian transkriptogram data RNAseq daripada glomerulus manusia laser microdissected (LMD) dan tubul proksimal DKD dannefrektomi rujukansampel mendedahkan laluan diperkaya termasuk reseptor seperti rhodopsin, isyarat penciuman, dan ribosom (terjemahan protein) dalam tubul proksimal sampel biopsi DKD manusia. Laluan terjemahan juga diperkaya dalam glomerulus. Peningkatan terjemahan dalambuah pinggang kencing maniss telah disahkan menggunakan pemprofilan poliribosomal dalam model tetikus db / db diabetes. Menggunakan penjujukan RNA nuklear tunggal (RNA-Seq) buah pinggang daripada tikus db/db, kami mengutamakan laluan tambahan yang dikenal pasti dalam DKD manusia. Laluan bertindih teratas yang dikenal pasti dalam kelompok tubul proksimal snRNAseq murine dan tubul proksimal LMD manusiapetak ialah katabolisme asid karboksilik. Menggunakan spektrometri jisim kromatografi cecair berprestasi ultra, laluan katabolisme asid lemak juga didapati tidak terkawal dalam model tetikus db/db. Metabolit Acetyl-CoA telah dikawal ke bawah dalam tikus db/db, sejajar dengan ekspresi pembezaan manusia gen ACOX1 dan ACACB. Ringkasnya, penemuan kami menunjukkan bahawa perubahan tiub proksimal dalam terjemahan protein dankatabolisme asid karboksilikadalah ciri utama dalam kedua-dua manusia danmurine DKD.

Kata kunci:tandatangan ekspresi gen; penjujukan RNA nuklear tunggal;metabolisme; pemprofilan ribosom

HERBA BARU UNTUKBUAH PINGGANG DIABETIS

1. Pengenalan

Diabetes mellitus (DM) menjejaskan lebih 400 juta orang di seluruh dunia [1] dan lebih 30 juta di AS [2]. Penyakit buah pinggang diabetes (DKD) adalah salah satu komplikasi DM yang paling serius, menjejaskan 19 juta orang di Amerika Syarikat [3], dan merupakan punca utamapenyakit buah pinggang peringkat akhir(ESKD) [4]. DKD secara klasik dilihat sebagai penyakit glomerular; Walau bagaimanapun, memberi tumpuan semata-mata pada patologi glomerular sebagai tapak utama kecederaan mengabaikan perubahan biologi utama dalam petak tubulointerstitial yang menyumbang kepada patofisiologi DKD [5]. Sesungguhnya, prognosis dan perkembangan DKD selalunya selari dengan atrofi tiub dan tahap penyakit interstisial [6,7]. Lebih lanjut ke tahap ini adalah bukti bahawa menyasarkan tubul proksimal dengan perencat SGLT2 memperlahankan perkembangan DKD [8].

Mekanisme selular yang membawa kepada perkembangan dan perkembangan DKD sememangnya kompleks. Lingkungan diabetes dicirikan oleh keabnormalan metabolik, keradangan, tekanan oksidatif, dan perubahan dalam homeostasis protein. Kesemua gangguan ini menyumbang kepada tekanan sel dan perkembangan DKD. Terdapat bukti yang semakin meningkat bahawa terjemahan yang diubah, langkah asas dalam ekspresi gen yang mencipta protein berfungsi, adalah penting dalam kedua-dua bertindak balas dan menyumbang kepada tekanan sel [9,10]. Perubahan dalam terjemahan menyumbang kepada ketidakseimbangan dalam homeostasis protein dan memberi kesan kepada kesihatan dan penyakit manusia [11-14].

Soal siasat spesimen biopsi buah pinggang manusia secara rutin menggunakan mikroskop cahaya, mikroskop elektron penghantaran, dan imunoreaksi untuk membolehkan ahli patologi membuat diagnosis dan prognosis. Walau bagaimanapun, alat diagnostik ini mempunyai batasan dalam mendedahkan mekanisme molekul yang mendasari penyakit buah pinggang termasuk DKD. Akibatnya, model haiwan DM secara sejarah telah digunakan untuk mengkaji mekanisme patofisiologi DKD; walau bagaimanapun, tiada satu pun daripada model ini mensimulasikan DKD manusia dengan sewajarnya [15]. Walaupun usaha baru-baru ini untuk menggunakan teknik soal siasat molekul yang lebih maju kepada spesimen biopsi buah pinggang manusia adalah menggalakkan [16], kami percaya menggunakan model haiwan selari dengan tisu buah pinggang manusia kekal sebagai pendekatan eksperimen yang penting untuk memberikan pandangan unik tentang asas molekul DKD.

Kami berusaha untuk memeriksa tandatangan ekspresi pembezaan DKD manusia dalam glomerulus dan tubul proksimal. Kami membuat hipotesis bahawa tandatangan transkriptom tubular proksimal, sebagai tambahan kepada glomerulus, juga menentukan hasil DKD. Kami menangani hipotesis ini dengan menyoal siasat spesimen biopsi buah pinggang manusia dengan microdissection laser kawasan tiub glomerular dan proksimal untuk mengenal pasti laluan yang berkaitan dengan DKD dan perkembangannya. Seterusnya, laluan utama telah disokong dalam model tetikus diabetes menggunakan pendekatan pelbagai mod penjujukan RNA nuklear tunggal (RNA-Seq), profil poliribosomal, dan metabolomik. Sebagai tambahan kepada kelainan dalam terjemahan protein, penemuan kami menyokong potensi peranan metabolisme asid karboksilik sebagai faktor utama dalam perkembangan penyakit buah pinggang diabetes.

HERB CISTANCHE FOR DIABETIC KIDNEY

2. Bahan dan Kaedah

2.1. Subjek Manusia

Kajian ini telah diluluskan oleh Lembaga Kajian Institusi Indiana University School of Medicine (IRB no. 190657223). Dua puluh tujuh sampel buah pinggang diperolehi daripada Konsortium Projek Perubatan Ketepatan Buah Pinggang dan Kohort Biopsi Biobank Indiana [17]. Biopsi buah pinggang adalah biopsi petunjuk untuk proteinuria atau penurunan fungsi buah pinggang dalam subjek diabetes mellitus. Lapan belas sampel diperoleh daripada orang dewasa dengan penyakit buah pinggang diabetes dan tanpa lesi glomerular kedua. Sembilan sampel rujukan tanpa bukti histologi DKD diperoleh daripada parenkim bukan neoplastik spesimen nefrectomy atau penderma yang telah meninggal dunia. Pembolehubah klinikal dan histopatologi telah diekstrak daripada rekod kesihatan elektronik. Anggaran kadar penapisan glomerular (eGFR) garis dasar ditakrifkan sebagai nilai yang paling hampir dengan tarikh biopsi melainkan penurunan 20% atau lebih besar dalam rujukan biopsi mendakan eGFR. Dalam senario ini, eGFR dalam tempoh 1 tahun sebelum biopsi dan sebelum penurunan 20% ditetapkan sebagai garis asas untuk pengiraan kemajuan.

2.2. Pembedahan Mikro Laser Tisu Buah Pinggang Manusia dan Penjujukan RNA

Cryosections dengan ketebalan 12 µm dipotong daripada blok tisu beku yang dipelihara dalam medium Suhu Pemotongan Optimum, dipatuhi pada slaid membran polifenilena sulfida (PPS), dan diproses menggunakan protokol Rapid Stain seperti yang diterangkan sebelum ini [18,19]. Luas minimum 500,000 µm2 telah dibedah untuk petak tiub glomerular dan proksimal menggunakan laser UV berdenyut pada Leica LMD6500 dan objektif 20x. Tisu yang dibedah dikumpulkan dalam tiub bebas RNAse steril yang mengandungi Penampan Pengekstrakan RNA dan RNA telah diasingkan mengikut arahan pengilang (Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit, ThermoFisher, Waltham, MA, USA). Kualiti RNA ditentukan menggunakan Agilent 2100 Bioanalyzer.

Penjujukan telah dilakukan di Indiana University Center for Medical Genomics Core. RNA Ribosom telah habis menggunakan protokol Kit RiboGone-Mammalian (Cat #634847, Takara Bio USA, Mountain View, CA, USA). Protokol Kit RNA Input Rendah Universal SMARTer v2 (Cat #634938, Takara Bio USA, Mountain View, CA, USA) telah digunakan untuk sintesis cDNA dan pembinaan perpustakaan. Penjujukan dilakukan dengan konfigurasi akhir berpasangan 2 × 75 bp pada Illumina HiSeq 4000 menggunakan HiSeq 3000/4000 PE SBS Kit, dan data yang dijujukan telah dipetakan ke genom hg38 menggunakan STAR. Bacaan penjujukan yang dipetakan secara unik telah diberikan kepada gen genom rujukan hg38 menggunakan Rsubread featureCounts [20,21].

HERB CISTANCHE FOR DIABETIC KIDNEY

2.3. Kelulusan Kajian Haiwan

Semua protokol haiwan telah diluluskan oleh Jawatankuasa Penjagaan Haiwan Institusi Universiti Indiana dan mematuhi Panduan Institut Kesihatan Nasional untuk Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Makmal. Untuk penjujukan RNA pukal, profil poliribosomal dan metabolomik, terikan tikus jantan C57BL/6J (#000664, kawalan latar belakang/C57 tikus) dan B6.BKS-Leprdb/J (#000697, tikus db) diperoleh daripada Makmal Jackson ( Bar Harbor, ME, Amerika Syarikat). Tikus berumur 9-12 minggu dan berat ~ 30 g (C57 tikus) atau 40-50 g (db tikus). Tikus telah dikorbankan dan buah pinggang telah dituai (n=4 atau 5 setiap kumpulan).

2.4. Pengasingan Tisu Buah Pinggang Tikus dan Penjujukan RNA Pukal

Buah pinggang dibekukan dan RNA diekstrak menggunakan Kit Midi QIAGEN RNeasy Plus dengan lajur penyingkiran DNA genomik. Kualiti RNA ditentukan menggunakan Agilent 2100 Bioanalyzer. Kit Persediaan Perpustakaan mRNA Illumina TruSeq Stranded telah digunakan untuk pembinaan perpustakaan. Penjujukan dilakukan dengan konfigurasi akhir berpasangan 2 × 75 bp pada Illumina HiSeq 4000 menggunakan HiSeq 3000/4000 PE SBS Kit, dan data yang dijujukan telah dipetakan ke genom mm10 menggunakan STAR. Bacaan penjujukan yang dipetakan secara unik telah diberikan kepada gen genom rujukan mm10 menggunakan Kiraan ciri Rsubread.

2.5. Pengasingan Tisu Buah Pinggang Tikus dan Penjujukan RNA Nuklear Tunggal

Tikus berumur 5, 8, 11, 16 dan 20 minggu telah dinilai (jumlah n=5, BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/J #000642). Heterozigot daripada strain yang sama digunakan sebagai kawalan latar belakang (n=3). Albumin air kencing diukur oleh kit ELISA albumin tetikus (Bethyl Laboratories, E99-134, Montgomery, TX, USA) dan kreatinin air kencing diukur dengan kit ujian kreatinin QuantiChrom (Bioassay System, DICT-500, Hayward , CA, Amerika Syarikat). Di atas ais, sebahagian daripada setiap buah pinggang ditambah kepada 1 mL penimbal lisis Nuklei EZ ditambah dengan 2% perencat protease (Thermofisher), dan 1% Superase (Thermofisher). Selepas mengisar, 1 mL penimbal ditambah dan tisu dihomogenkan menggunakan Pengisar Tisu Dounce KONTES (Kimble Chase, Rockwood, TN, USA). Homogenate dicampur perlahan-lahan dengan 2 mL penimbal dan diinkubasi di atas ais selama 5 minit. Homogenat ditapis melalui penapis 40 µm dan dirawat dengan penimbal lisis ditambah dengan 1% Superbase, kemudian ditapis semula melalui30 µm penapis, dan kemudiannya digantung semula dalam PBS ditambah dengan 2% BSA dan 1%Superase. Penggantungan ini kemudiannya ditapis melalui 5µm penapis dan kepekatantelah diselaraskan kepada 1-3 juta nukleus / mL sebelum penyerahan untuk penjujukan.

Nuklear tunggal 30 penjujukan RNA telah dilakukan di Indiana University Center for Medical Genomics Core menggunakan sistem sel tunggal Chromium versi 3 (10 × Genomics, San Francisco, CA, USA) dan Penjujukan NovaSeq6000 (Illumina, San Diego, CA, Amerika Syarikat). Cell Ranger 4.0 telah digunakan untuk menjana fail FASTQ khusus sampel dan bacaan diselaraskan dengan genom rujukan mm10 menggunakan STAR. Seurat v 3.0.1 digunakan untuk menyepadukan sampel menggunakan metrik kawalan kualiti berikut: termasuk kiraan gen antara 200–3000 dan peratus gen mitokondria kurang daripada 50%. Secara keseluruhan, 58,405 sel telah dikekalkan untuk analisis hiliran. Prapemprosesan standard, pemilihan ciri, pengurangan dimensi (20 komponen utama), pengenalpastian penambat antara sampel, dan penyepaduan telahdilakukan mengikut kaedah penambat Seurat v3.Kelompok telah diberi anotasi berdasarkanpenanda ekspresi gen biasa [22] dan menggunakan Penjelajah Sel Buah Pinggang [23].

HERB CISTANCHE FOR DIABETIC KIDNEY

2.6. Pengasingan Tisu Buah Pinggang Tikus dan Pemprofilan Poliribosom

Kawalan latar belakang dan tikus db telah dikorbankan pada usia 9 dan 12 minggu. Perfusi jantung melalui ventrikel kiri dilakukan dengan 6 mL sikloheksimid (100 µg/mL dalam PBS). Buah pinggang yang dituai segera diletakkan dalam penimbal lisis yang terdiri daripada 1% Triton X-100, 0.1% deoxycholate, 20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablet (Roche, Penzberg). , Jerman), 50 µg/mL cycloheximide, dan RNAsin (pencairan 1:500). Tisu dihomogenkan pada 4 ◦C menggunakan homogenizer tisu Precellys (Precellys, Montigny-le-Bretonneux, Perancis). Homogenat tisu diinkubasi pada ais selama 10 minit, kemudian disentrifugasi pada 9600 × g selama 10 minit. Supernatan telah ditambah ke bahagian atas kecerunan sukrosa yang dijana oleh Master Gradient BioComp (10% sukrosadi atas 50% sukrosa dalam 20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, dan 50 mg/mLcycloheximide) dan disentrifugasi pada 284,000× g selama 2 jam pada 4◦C. Kecerunan telah dituaidari atas dalam penuai Biocomp (Instrumen Biocomp, Fredericton, NB, Kanada),dan kandungan RNA pecahan ribosom yang dicairkan secara berterusan dipantau dengan UVpenyerapan pada 254 nm.

2.7. Metabolomik

Untuk menilai tandatangan metabolomik, sampel kawalan latar belakang dan tikus db (n=5 setiap kumpulan) disediakan menggunakan sistem MicroLab STAR® automatik (Hamilton Company, Reno, NV, USA). Analisis metabolik telah dilakukan di Metabolon Inc. Secara ringkas, tisu buah pinggang beku telah diproses mengikut kaedah pengekstrakan standard Metabolon mengikut protokol syarikat. Ekstrak telah dianalisis pada kromatografi cecair ultra-prestasi Waters ACQUITY (UPLC) dengan lajur C18 (Waters UPLC BEH C18-2.1 × 100 mm, 1.7 µm) dan Thermo Scientific Q-Exactive resolusi tinggi/tepat spektrometer jisim yang disambungkan dengan sumber pengionan elektrospray yang dipanaskan (HESI-II) dan penganalisis jisim Orbitrap yang dikendalikan pada 35,000 resolusi jisim.

Data mentah telah diekstrak, dikenal pasti puncak dan QC diproses menggunakan perkakasan dan perisian Metabolon (Durham, NC, USA). Puncak dikira menggunakan luas di bawah lengkung. Analisis statistik standard dengan ujian-t dua sampel Welch telah dilakukan dalam ArrayStudio pada data yang diubah log.

2.8. Ekspresi Gen Berbeza, Analisis Laluan dan Statistik

Data ekspresi tisu buah pinggang LMD manusia dan tetikus daripada penjujukan RNA telah dinormalkan secara kuantil dan ungkapan pembezaan ditentukan menggunakan ujian tepat dalam edgeR dengan nilai p < 0.05 dianggap signifikan secara statistik selepas Benjamini–Hochberg palsu kadar penemuan (FDR) pembetulan berbilang ujian. Untuk sampel buah pinggang tetikus yang menjalani penjujukan snRNA, ungkapan pembezaan ditentukan menggunakan ujian Jumlah Kedudukan Wilcoxon dengan nilai p terlaras Bonferroni < 0.05 dianggap signifikan secara statistik. Walau bagaimanapun, nilai-p yang tidak diperbetulkan disediakan dalam manuskrip. Data ekspresi gen telah disiasat untuk laluan diperkaya dalam Gene Ontology, Kegg, dan Reactome menggunakan analisis rangkaian transkrip seperti yang diterangkan sebelum ini [19,24-26]. Secara ringkas, semua gen pengekodan protein, tanpa mengira nilai p, dipesan oleh rangkaian interaksi protein-protein. Algoritma Monte Carlo digunakan untuk mengelompokkan gen oleh fungsi biologi yang dikongsi. Kepentingan ditentukan menggunakan ujian-t Welch dua ekor selepas 500 pilih atur rawak untuk menganggar kadar penemuan palsu dengan nilai p <0.05 dianggap signifikan secara statistik. Oleh kerana hanya subset gen yang dinyatakan dalam mana-mana sel tertentu untuk data snRNA-seq, kaedah transkriptogram tidak boleh dilaksanakan untuk jenis data ini. Analisis laluan untuk snRNA-seq melibatkan pengayaan gen yang dinyatakan secara berbeza dalam Gene Ontology, Kegg, dan Reactome mengikut ujian tepat Fisher, tanpa mengambil kira interaksi rangkaian protein-protein. Semua kelompok sel tubular proksimal merentasi semua titik masa telah digabungkan untuk mengenal pasti gen yang diperkaya antara tikus kawalan dan db. Kelompok podosit tunggal juga digabungkan merentasi titik masa. Kaedah ini digunakan pada data RNA-seq manusia juga apabila menilai pertindihan dengan dataset snRNA-seq. Nilai p yang diperbetulkan FDR untuk laluan digunakan untuk mengenal pasti pertindihan antara sub-segmen yang sepadan. PAM (pembahagian sekitarmedoids) digunakan untuk mengelompokkan sampel diabetes manusia mengikut gen yang terlibat dalam setiap laluan bertindih. Ciri klinikal pembezaan ditentukan menggunakan ujian Wilcoxon Rank Sum antara kumpulan berkelompok.