Kesan Berfaedah/Tidak Menguntungkan Quercetin Pada Membran Sel Neuroblastoma SK-N-SH Bahagian 2

Sila klikoscar.xiao@wecistanche.comuntuk maklumat lanjut

2.2.2. Aktiviti Antioksidan Quercetin

Untuk menguji keberkesanan kuersetin dalam melindungi membran daripada tekanan oksidatif, eksperimen telah dilakukan di mana model lipid membran terdedah kepada ozon tanpa kehadiran （Rajah 4a） dan kehadiran kuersetin pada kepekatan 6.25 μM (Rajah 4b).

Di bawah pengaruh ozon, perjalanan kedua-dua kebergantungan, iaitu, π{{0}}f(A)dan Cs-1=f(rn)berubah. Isoterma yang diperoleh untuk penyebaran monolayer pada subfasa yang mengandungi ozon dicirikan oleh cerun yang lebih kecil dan peralihan ke arah nilai A yang lebih rendah. Selain itu, nilai Cs-1 menurun di bawah pengaruh ozon. Perubahan ini paling besar pada kepekatan ozon kira-kira 0.4 ppm.cintanchePeningkatan selanjutnya dalam kepekatan ozon tidak meningkatkan perubahan ciri-ciri monolayer (Rajah 4a inset).

Rajah 4. Isoterma tekanan permukaan dan modulus kebolehmampatan sepadan (inset) model lipid lapisan neuroblastoma yang tersebar pada subfasa mengandungi kepekatan ozon terlarut yang ditunjukkan dalam penimbal. Isoterma:(a)ketiadaan antioksidan;（b）dengan kehadiran kuersetin （6.25 μM） ditambah kepada penimbal yang mengandungi ozon.

Apabila kuersetin pada kepekatan 6.25 μM dimasukkan ke dalam subfasa, ozon tidak menjejaskan perjalanan isoterma r(A) dengan ketara; walau bagaimanapun, nilai modulus mampatan berubah dalam kehadiran ozon sama seperti dalam kes ketiadaan kuersetin (sisipan Rajah 4b).

Sila klik di sini untuk mengetahui lebih lanjut

Nilai berangka parameter yang mencirikan lapisan tunggal yang ditentukan berdasarkan isoterma yang diperolehi dibentangkan dalam Jadual 3.

Jadual 3. Parameter permukaan lapisan tunggal Alim dan Cs-I yang dikira untuk lapisan tunggal model membran neuroblastoma yang tersebar pada subfasa mengandungi kepekatan ozon yang dinyatakan dalam penampan tanpa kehadiran dan dengan kehadiran kuersetin (6.25 uM). Data mewakili min daripada tiga eksperimen ± SD. Huruf yang berbeza menunjukkan perbezaan yang ketara (p Kurang daripada atau sama dengan 0.05).

Dengan kehadiran ozon, sedikit pengurangan dalam kawasan permukaan setiap molekul (Alim) dalam satu lapisan padat padat diperhatikan. Pengurangan maksimum parameter ini ialah 3.2 peratus berbanding kawalan (monolayer pada penimbal tulen). Parameter Cs-I juga dikurangkan, mencapai nilai dataran tinggi pada kepekatan ozon melebihi 0.6 ppm O. Pengurangan maksimum parameter ini mencapai 24 peratus berhubung dengan kawalan.

Apabila quercetin pada kepekatan 6.25 uM hadir dalam subfasa, nilai Alim (1-2 peratus ) berkurangan sedikit, manakala pengurangan dalam nilai Cs-1adalah kira-kira 27 peratus .

Sifat perubahan Alim dengan kehadiran ozon dan ozon dalam kombinasi dengan kuersetin mempunyai kursus yang berbeza. Pada kepekatan ozon kira-kira 0.3 ppm, jika tiada kuersetin, Aimmenurun secara mendadak kepada kira-kira 88.3 A2. Ia kemudiannya mencapai nilai dataran minimum yang memberikan ciri pergantungan bentuk S (Rajah 5a, titik merah). Dengan kehadiran kuersetin, terdapat sedikit penurunan monotonik licin Alim, mencapai kepekatan ozon yang lebih tinggi iaitu dataran tinggi kira-kira 93.5 A2(Rajah 5a, titik hijau).

Rajah 5. Kebergantungan kawasan per molekul pada kepekatan ozon (a) dan pergantungan modulus mampatan pada kepekatan ozon (b) untuk membran neuroblastoma pada subfasa: Tanpa titik merah kuersetin; dengan mata kuersetin-hijau. Garisan tidak menunjukkan sebarang model fizikal, dipasang secara matematik dan dilukis untuk kemudahan menjejaki perubahan parameter. Nilai modulus mampatan lapisan maksimum berubah sama dengan kepekatan ozon untuk kedua-duanya: Jika tiada dan kehadiran kuersetin (Rajah 5b).

3. Perbincangan

Mekanisme tindakan quercetin telah dikaji secara intensif selama bertahun-tahun, tetapi hasil eksperimen sering bercanggah dan menunjukkan bahawa dalam beberapa keadaan, sebatian ini bermanfaat, dan pada yang lain, tidak menguntungkan untuk sel. Analisis kajian yang ada menunjukkan bahawa kesan sebatian ini terhadap sel adalah berkaitan dengan dua aspek, iaitu interaksinya dengan membran dan aktiviti antioksidan. Walau bagaimanapun, dalam sel, adalah tidak mungkin untuk membezakan kedua-dua mod tindakan kuersetin ini dan penilaian kesesuaian sebatian ini sebagai bahan berpotensi, contohnya, mempunyai aktiviti antitumor. Atas sebab ini, eksperimen telah dirancang sedemikian rupa untuk menilai secara kualitatif dan kuantitatif pengaruh sebatian ini pada sifat mekanikal membran, serta aktiviti antioksidannya dalam sistem model, yang menghapuskan kesan aktiviti laluan metabolik lain.

Berdasarkan eksperimen yang dilakukan, telah disahkan bahawa walaupun pada kepekatan terendah (6.25 uM), quercetin mengubah suai (seperti yang ditunjukkan oleh peningkatan Alimvalue) model monolayers, meniru bahagian lipid membran sel neuroblastoma. Ia menunjukkan kemungkinan interaksi kuersetin dengan membran sel-sel ini apabila sampai ke otak, walaupun pada kepekatan rendah. Ini amat penting untuk sel saraf yang membrannya mengandungi jumlah lipid yang agak besar.

Cistanche boleh meningkatkan imuniti

Anggaran nisbah lipid-protein untuk sel saraf ialah 80:20 peratus, dan sebagai contoh, untuk membran eritrosit, nisbah ini ialah 50:50 peratus [29]. Tahap lipid sedemikian dalam membran sel saraf dikaitkan dengan peranan sel-sel ini dalam menghantar isyarat elektrik. Pada masa yang sama, walaupun perubahan halus dalam sifat fizikokimia, seperti fleksibiliti dan kekakuan, membran sel, boleh mengganggu fungsi ini dengan ketara.

Potensi tindakan dipindahkan di sepanjang membran sel saraf terima kasih kepada kerja saluran ion, dan kemudian, terima kasih kepada tindakan pam ion, potensi rehat dipulihkan. Fungsi protein ini (khususnya, ditentukan oleh bentuknya) sangat bergantung pada persekitaran lipid. Selain itu, perubahan dalam sifat mekanikal membran boleh mengganggu operasi saluran yang mekanisme gatingnya bergantung dengan tepat pada sifat mekanikal membran.

Tesis ini disahkan oleh kajian yang menunjukkan bahawa kesan kuersetin pada membran sel berkaitan, antara lain, dengan pengangkutan ion Ca2 tambah dan/atau metabolisme Ca2 tambah [30,31]. Oleh itu, pengenalan molekul kuersetin ke dalam persekitaran membran (terutamanya sel saraf) mungkin mempunyai akibat yang ketara terhadap fungsinya.

Untuk memeriksa sama ada tindakan kuersetin yang ditentukan dalam sistem model memainkan peranan yang bermanfaat atau tidak menguntungkan dalam sel, keputusan yang diperoleh untuk membran model dibandingkan dengan kesan sebatian ini pada keseluruhan sel neuroblastoma. Untuk sel SK-N-SH, ujian MTT telah dilakukan,Ekstrak Cistanche Anti Alzheimermemberi maklumat tentang daya maju sel sel yang berkadar terus dengan enzim dehidrogenase mitokondria.

Keputusan yang diperolehi menunjukkan bahawa kehadiran kuersetin pada kepekatan 100 dan 200uM meningkatkan bilangan sel yang berdaya maju. Keputusan yang sama diperoleh oleh Bao et al. [32], menyiasat kesan kuersetin pada sel-12 PC. Kebocoran LDH ke dalam persekitaran ekstraselular, yang memberikan maklumat tentang gangguan membran sel, juga diperiksa pada tahap kuersetin yang sama. Keputusan yang diperoleh menunjukkan bahawa membran sel yang diuji tidak rosak dalam keadaan sedemikian. Boots et al. [2], mengkaji kesan quercetin pada sel epitelium paru-paru, memerhatikan hasil yang sama. Oleh itu, boleh disimpulkan bahawa pada kepekatan ini, quercetin mempunyai kesan positif pada sel, meningkatkan Daya maju mereka.

Aspek kedua penting dalam mekanisme tindakan kuersetin adalah berkaitan dengan sifat antioksidannya. Untuk menilai kesan berkaitan polifenol yang dikaji, eksperimen telah dijalankan di mana ia diperiksa sama ada quercetin memainkan peranan perlindungan dalam sel yang terdedah kepada tekanan oksidatif. Tekanan oksidatif dijana dengan memperkenalkan H, O2 ke dalam persekitaran sel.Cistanche untuk meningkatkan daya ingatanSeperti yang ditunjukkan dalam kajian ini, hidrogen peroksida menyebabkan kematian sel yang ketara, dinyatakan sebagai kerosakan kepada mitokondria.

Apabila sel SK-N-SH dibiakkan selama 3 jam dalam medium yang mengandungi 3 dan 5 mM H2O2, daya maju sel menurun kepada kira-kira 44 peratus daripada sel yang tidak dirawat (ujian MTT). Kajian menunjukkan bahawa prarawatan 24 jam sel dengan kuersetin menyebabkan peningkatan bilangan sel hidup berhubung dengan sel yang dirawat dengan H2O2. Suematsu et al. [13] melaporkan kesan yang sama.

Kami juga mengukur tahap MDA, yang merupakan biomarker tekanan oksidatif sebagai produk akhir peroksidasi lipid [33]. Prarawatan sel dengan kepekatan kuersetin yang tinggi, diikuti dengan penambahan hidrogen peroksida, menghasilkan sedikit peningkatan kandungan MDA berbanding dengan sel yang terdedah kepada H O, sahaja. Ini mungkin kerana quercetin (pada kepekatan yang lebih tinggi) juga boleh menjalani pengaktifan oksida-reduktif dan menjadi subjek kitaran redoks, menjana spesies oksigen reaktif intraselular [34].

Tiada perubahan ketara dalam pemusnahan membran (seperti yang ditunjukkan oleh tahap LDH yang tidak berubah) sel yang dirawat dengan kuersetin dan H2O2 berbanding kes apabila sel terdedah kepada tekanan oksidatif sahaja. Oleh itu, boleh disimpulkan bahawa walaupun terdapat peningkatan peroksidasi lipid (pada kepekatan kuersetin yang tinggi), ini tidak cukup ketara untuk memusnahkan membran dan mengganggu kesinambungannya.

Pemerhatian yang diperolehi untuk sistem asli telah dihadapkan dengan yang diterima untuk sistem model di mana ia adalah mungkin untuk mengawal dengan tepat kedua-dua kepekatan kuersetin dan tahap tekanan. Ia telah diperiksa bagaimana bahagian lipid membran neuroblastoma tahan terhadap tekanan oksidatif. Keadaan tekanan dicipta dengan memasukkan ozon ke dalam penampan, di mana ozon persekitaran air mengalami tindak balas penguraian membentuk radikal oksidatif, antara lain radikal hidroksil dan radikal anion superoksida [35]. Campuran spesies oksigen reaktif yang diperoleh sepadan dengan yang berlaku secara semula jadi dalam sel, disebabkan oleh ketidakseimbangan gangguan status redoks [36-38].

Di bawah pengaruh tegasan, bentuk isoterma berubah, menunjukkan penurunan ketara dalam kawasan setiap molekul tunggal dalam monolayer padat. Perubahan sedemikian berlaku disebabkan oleh pengoksidaan ikatan tak tepu dalam rantai asid lemak. Kesan ini meningkat dengan peningkatan kepekatan ozon kepada kira-kira {{0}}.3 ppm, dan kemudian parameter isoterma ini kekal pada tahap yang sama walaupun terdapat peningkatan dalam ROS. Ini bermakna pada kepekatan ozon kira-kira 0.3 ppm, semua asid lemak tak tepu yang terdapat dalam lapisan tunggal telah teroksida (dalam model neuroblastoma, jumlah keseluruhan asid lemak tak tepu ialah 52 peratus)

Lapisan tunggal teroksida mempunyai kekakuan yang besar,cistanche dalam bahasa Cinaseperti yang diwakili oleh nilai Cs-1 (semakin tinggi nilai parameter ini, semakin besar kekukuhan lapisan). Dengan kehadiran kuersetin, walaupun pada kepekatan rendah （6.25 μM）, pengubahsuaian membran yang terdedah kepada ozon, seperti yang digambarkan oleh perubahan dalam nilai Alim, telah dikurangkan dengan ketara (Rajah 5a), yang membuktikan aktiviti antioksidan sebatian ini. . Perlu diingat, walau bagaimanapun, walaupun quercetin menghilangkan radikal, melindungi asid lemak tak tepu daripada pengoksidaan, ia tidak membalikkan perubahan dalam kekakuan membran (Rajah 5b).

Oleh itu, telah ditunjukkan bahawa quercetin mempamerkan tindakan antioksidan, tetapi kehadirannya di antara molekul lipid mempengaruhi (menentukan) parameter bejana, iaitu, walaupun rantai asid lemak dilindungi daripada pengoksidaan, kekakuan membran menurun dengan ketara (Cs- Saya nilai kira-kira 25 peratus lebih rendah berbanding kawalan).

Keputusan ini menunjukkan bahawa ia adalah perubahan membran yang merupakan faktor utama dalam kesan selular yang terhasil daripada kehadiran kuersetin. Walau bagaimanapun, akibat daripada perubahan ini (pengubahsuaian isyarat, pengangkutan) berbeza-beza bergantung pada bilangan molekul polifenol, komposisi awal membran, dan fungsi sel. Ini menjelaskan mengapa, dalam keadaan yang berbeza dan dalam kajian yang berbeza, quercetin menunjukkan kesan perlindungan, manakala pada yang lain adalah sebaliknya.

Dalam keadaan tekanan oksidatif yang tinggi, kesan antioksidan membantu sel dengan melindungi komponennya daripada kerosakan. Walau bagaimanapun, jika membran diubah suai dengan ketara dengan menempatkan sebatian ini dalam persekitarannya yang mengakibatkan pengedaran laluan isyarat atau pengangkutan dengan kekakuan membran yang berubah, ini boleh membawa kepada kesan yang tidak baik. Ia juga harus diingat bahawa banyak proses dalam sel berlaku serentak, kedua-dua yang berkaitan dengan membran dan yang menghasilkan tekanan oksidatif. Kesan yang boleh diperhatikan dan diukur dengan menentukan tahap penunjuk tertentu sentiasa jumlah. Oleh itu, terdapat situasi di mana kesan kuersetin dilihat sebagai menguntungkan dan tidak menguntungkan.

4. Bahan dan Kaedah

4.1.Bahan

Komposisi model bahagian lipid membran sel neuroblastoma telah ditubuhkan berdasarkan kerja oleh pengarang [39-41]. Fosfolipid: 1-oleoyl-2-palmitoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine;1-hexacosanoyl-d4-2-hydroxy-sn-glycerol-3-phosphocholine; 1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-fosfokolin; L- -phosphatidylethanolamine (Otak); sphingomyelin (Otak)-(Avanti Polar Lipid Inc., Alabaster, AL, Amerika Syarikat). Kolesterol dikejar-kejar (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Jerman). Nisbah fosfolipid kepada kolesterol ialah 79 peratus hingga 21 peratus. Nisbah asid lemak tepu kepada tak tepu ialah 48 peratus hingga 52 peratus .

Pelarut (kloroform, etanol) ketulenan kimia-Poch (Gliwice, Poland); air ternyahion baru yang dihasilkan oleh HLP 5 Hydrolab (Straszyn, Poland). Medium kultur, serum dan antibiotik telah dibeli daripada CytoGen GmbH. Reagen kimia yang digunakan dalam eksperimen diperoleh daripada Sigma Aldrich.

4.2.Budaya Sel

Talian sel neuroblastoma manusia SK-N-SH (The European Collection of Authenticated Cell Cultures(ECACC) telah dikultur dalam 10 peratus serum lembu janin (FBS) dalam Medium Helang Modified(DMEM) Dulbecco, ditambah dengan 0.01 peratus penisilin -streptomycin pada 37 darjah dalam suasana lembap, mengandungi 5 peratus CO2.

4.3. Pengukuran Daya Tahan Sel (Ujian MTT)

Sel telah disemai dalam plat telaga {{0}}pada ketumpatan 1×104 sel setiap telaga dalam isipadu 0.1 mL. Sel-sel telah dirawat selama 24 jam dengan pelbagai kepekatan kuersetin (3.75-200 μM）. Selepas masa ini, 3 mM dan 5 mM hidrogen peroksida telah ditambah selama 3 jam. Disebabkan kekurangan perbezaan antara kesan Kepekatan HO2 at3 dan 5 μM, untuk kajian statistik, ia dianggap sebagai rawatan yang sama dan diterangkan sebagai rawatan 3-5 uM H2O2.

Selepas itu 50}μL MTT（3-【4,5-dimetiltiazol-2-yl】-2,5 larutan difenil tetrazolium bromida）(larutan stok steril 5 mg / mL) telah ditambah ke dalam sel dan diinkubasi selama 2 jam pada 37 darjah dalam 5 peratus CO, atmosfera yang lembap. Kemudian, 0.4 mL dimetil sulfoksida(DMSO) telah ditambah ke dalam setiap perigi dan disimpan selama 10 minit. Selepas sentrifugasi, ketumpatan optik supernatan diukur pada 570 nm menggunakan pembaca plat mikroliter (BioTek Instruments, VT, USA).

4.4.Ujian Kerosakan Mem1brane (Ujian LDH)

Ujian laktat dehidrogenase (LDH) digunakan sebagai penanda keseluruhan membran sel.

Sel-sel dalam jumlah 1× 1{{10}}}* sel setiap telaga telah disemai dalam 96-plat perigi dan diinkubasi dengan kehadiran kuersetin （3.75-200 μM） selama 24 jam; Kemudian, 3 mM dan 5 mM H2O, ditambah selama 3 jam. Kepada tiub yang mengandungi0.5 mL 0.75 mM natrium piruvat dan 10 uL NADH（140 μM）（dipanaskan pada 37C selama 10 minit）, 150 μL supernatan ditambah dan diinkubasi selama 30 minit pada 37 darjah. Kemudian 0.5 mL 2,4-dinitrophenylhydrazine ditambah kepada sampel, dan selepas 1 jam penyerapan diukur pada 450 nm.

4.5. Penentuan Pengoksidaan Lipid (Kepekatan MDA)

Peroksidasi lipid membran dianggarkan oleh tindak balas asid thiobarbituric (TBA) dengan malondialdehid (MDA). Sel telah disemai dalam {{0}}plat perigi yang mengandungi kuersetin dan H, O2 (dalam kepekatan dan masa yang diterangkan di atas) dalam jumlah 1×104 sel setiap telaga dalam isipadu { {10}}.25 mL. Selepas rawatan, sampel dikumpul dan disentrifugasi (1000×&,5min). Pada pelet, 0.5 mL 0.5 peratus TCA telah ditambah, dipusingkan selama 1 minit dan disaring melalui penyinaran selama 5 minit. Selepas sentrifugasi pada 10,000×g selama 10 minit, 0.4 mL supernatan telah ditambah kepada 1.25 mL 20 peratus TCA dengan 0.5 peratus TBA dan dipanaskan dalam thermoblock kering (100 darjah ) selama 30 minit. Selepas penyejukan, penyerapan diukur pada 532 nm menggunakan pekali kepupusan molar MDA bersamaan dengan 155 M-1 cm-1.

4.6.Membran Model

Pengozonan Penampan. Penampan fosfat(0.01 M, pH 7.4)telah tepu dengan ozon yang dihasilkan oleh penjana ozon FM 500 (Grekos, Poland). Kepekatan ozon dalam penampan ditentukan mengikut Bader dan Hoigne [42].

Isoterma Tekanan Permukaan.pertumbuhan zakar cistanchePalung Langmuir (KSV, Finland) digunakan untuk pendaftaran isoterma tekanan permukaan pada kadar mampatan tetap bersamaan dengan kelajuan penghalang 5 mm/min. Monolayer lipid dibentuk dengan menyebarkan jumlah tertentu larutan kloroform lipid pada kepekatan 1 mg/mL pada subfasa yang terdiri daripada penimbal fosfat 0.01 M, pH 7.4 dengan atau tanpa kuersetin dan dengan atau tanpa ozon. Ketegangan permukaan diukur dengan plat Pt-Wilhelmy. Eksperimen telah dilakukan pada 25 darjah ±1 darjah .

4.7. Analisis statistik

Tiga hingga enam analisis bebas telah dilakukan untuk setiap varian yang diuji dan purata (± SD). Perbezaan ketara berbanding dengan kawalan dianggarkan dengan mengeksploitasi prosedur SAS ANOVA. Analisis statistik dilakukan oleh ujian julat berganda Duncan, mengambil p<0.05. statistical="" tests="" were="" carried="" out="" using="" statistica="" 13.3(cracow,="">

Sumbangan Pengarang: Pengkonsepan, BK, BD, dan ER-S.methodology, BKBD; perisian, BK, BDvalidation, BK, BD, ER-S., ABwriting—penyediaan draf asal BK, BD, ER-S., penulisan—semakan dan penyuntingan, BK, BD, ER-S., ABvisualization, BK, BDsupervision, BK, BD, ER-S., ABASemua pengarang telah membaca dan bersetuju dengan versi manuskrip yang diterbitkan.

Pembiayaan:Penyelidikan ini tidak menerima pembiayaan luar.

Penyata Lembaga Semakan Institusi: Tidak berkaitan.

Kenyataan Persetujuan Termaklum: Tidak berkaitan.

Penyata Ketersediaan Data: Data terkandung dalam artikel. Konflik Kepentingan: Pengarang mengisytiharkan tiada konflik kepentingan.

Artikel ini diekstrak daripada Molecules 2021, 26, 4945. https://doi.org/10.3390/molecules26164945 https://www.mdpi.com/journal/molecules