Acteoside dalam Tumbuhan Asli Cina-Cistanche Untuk Merawat Penyakit Buah Pinggang--Bahagian I
Mar 03, 2022
Kenalan: emily.li@wecistanche.com
Produk semulajadi acteoside memperbaiki kecederaan buah pinggang dalam tikus diabetes db/db dan sel HK-2 melalui mengawal selia laluan isyarat NADPH/ oksidase-TGF- /Smad
Qinwen Wang|Xinxin Dai et.al
Kajian ini direka untuk menyiasat kesan perlindungan dan mekanismeacteosidepada DKD dalam tikus db/db lelaki diabetes dan sel HK-2 tinggi yang disebabkan oleh glukosa. Tikus diabetes db/db dibahagikan secara rawak kepada kumpulan model, kumpulan metformin, kumpulan irbesartan, danacteosidekumpulan. Kami memerhatikan produk semula jadi daripadaacteosidemempamerkan kesan yang ketara dalamperlindungan buah pinggangmelalui analisis penunjuk biokimia dan metabolit endogen, pemerhatian histopatologi, dan penghapusan barat. Sel HK-2 yang tertakluk kepada glukosa tinggi telah digunakan dalam eksperimen in-vitro. Mekanisme molekul telah disiasat oleh RT-PCR dan western blot.Acteosidemenghalang sel HK-2 yang disebabkan oleh glukosa tinggi dan tikus db/db diabetes dengan menghalang laluan isyarat NADPH/oxidase-TGF- /Smad.Acteosidemengawal selia laluan metabolik metabolisme lipid yang terganggu, metabolisme glioksilat dan dikarboksilat, dan metabolisme asid arakidonik. Kami menemui produk semula jadi daripadaacteosidemempamerkan kesan yang ketara terhadapperlindungan buah pinggang.Kajian ini membuka jalan untuk penerokaan lanjut tentang patogenesis, diagnosis awal, dan pembangunan agen terapeutik baru untuk DKD.
KATA KUNCI acteoside, kencing manispenyakit buah pinggang, pemprofilan metabolik, laluan isyarat NADPH/oksidase-TGF- /Smad, ROS
Bahagian I
Acteoside merawat Penyakit Buah Pinggang
1|PENGENALAN
Acteosideadalah komponen perwakilan glikosida phenylethanoid, diedarkan secara meluas dalam 79 genera tumbuhan, seperti Rehmannia glutinosa,Cistanche deserticola, dan tumbuhan ubatan lain.Acteosidedicirikan oleh asid caffeic dan hydroxytyrosol yang terikat pada bahagian glukosa melalui ikatan ester dan glikosidik, masing-masing, dengan unit rhamnose yang dikaitkan dengan molekul glukosa (Zhao et al., 2015). Dilaporkan bahawaacteosidemempunyai aktiviti farmakologi secara meluas, sepertibuah pinggangperlindungan (Gan et al., 2018), antioksida (He et al., 2011), neuroprotection (Li, Zhou, Xu, Song, & Lu, 2018), perlindungan hati (Lee et al., 2004), antikanser (Ohno , Inoue, Ogihara, & Saracoglu, 2002), dan sebagainya. Walau bagaimanapun, kesan perlindungan daripadaacteosidedalam kencing maniskecederaan buah pinggangtidak jelas.
Diabetes adalah salah satu kecemasan kesihatan global yang paling pesat berkembang pada abad ke-21. Pada 2019, dianggarkan 463 juta orang menghidap diabetes dan jumlah ini diunjurkan mencecah 578 juta menjelang 2030, dan 700 juta menjelang 2045. Prevalens global diabetes berkembang pesat, terutamanya di negara membangun, dan prevalens diabetespenyakit buah pinggang(DKD) dan peringkat akhirpenyakit buah pinggang(ESRD) terus meningkat (Hu, 2011). DKD adalah salah satu komplikasi mikrovaskular kronik diabetes yang paling ditakuti dan punca utama ESRD. Kematian semua sebab pada individu dengan DKD adalah kira-kira 30 kali lebih tinggi daripada pesakit diabetes tanpa nefropati. Kajian terkini menunjukkan bahawabuah pinggangperalihan epitelium-mesenchymal tiub (EMT) dan pengumpulan matriks extracytoplasmic (ECM) dalambuah pingganginterstitium memainkan faktor utama dalam patogenesis DKD (He et al., 2015; Yao et al., 2014). Kajian yang semakin meningkat telah melaporkan bahawa perkembanganbuah pinggangfibrosis dalam nefropati diabetik telah dimediasi oleh banyak laluan isyarat. TGF- telah dikaitkan sebagai faktor patogenik utama dalam kebanyakan jenis CKD yang dikaitkan dengan fibrosis, termasuk DKD (Lv & Zhang, 2019). Kompleks isyarat heteromerik, terhasil daripada pengikatan TGF- 1 kepada reseptor jenis II dan seterusnya reseptor jenis I, memindahkan isyarat melalui Smad yang dikawal selia reseptor (Smad2/3) dan Smad rakan kongsi biasa (Smad4), yang membawa kepada peraturan transkrip gen sasaran (Sierra et al., 2015). Pengumpulan ROS boleh membawa kepada tekanan oksidatif dalam sel, yang membawa kepada kerosakan komponen selular termasuk protein dan DNA. Akhirnya, tekanan oksidatif membawa kepadabuah pinggangfibrosis dan penurunan dalamfungsi buah pinggang. NADPH oxidases (NOX) diterima sebagai sumber utama penjanaan ROS dalam nefropati diabetik dan kronik.penyakit buah pinggang. Regulasi atas dan pengaktifan hiper NOX juga berkemungkinan menyumbang kepada tekanan oksidatif dalam peringkat patofisiologi. Ketinggianbuah pinggangTahap ROS melalui pengaktifan NOX pengantara hiperglikemia mengakibatkan tekanan oksidatif, yang mendorong kerosakan kepadatisu buah pinggang, menyebabkan DKD (Lee, An, Kim, & Bae, 2020).
Metabolomik ialah teknologi omik baharu dan penting untuk analisis kualitatif dan kuantitatif semua metabolit molekul kecil dalam sel hidup, tisu dan cecair badan. Sebagai disiplin baharu untuk mengenal pasti perubahan metabolik keseluruhan organisma hidup, metabolomik memberikan pandangan baharu tentang kajian diabetes dan komplikasi diabetes (Lu, Xie, Jia, & Jia, 2013).
Tujuan kajian ini adalah untuk menyiasat kesan perlindungan produk semula jadiacteosidepada DKD tikus db/db lelaki diabetes dan sel HK-2 yang disebabkan oleh glukosa tinggi secara in vitro dan mekanismenya. Jadi, dalam kajian ini, tikus db/db telah diterima pakai untuk menilaibuah pinggangkesan perlindungan daripadaacteoside, dan peraturan metabolit yang berbeza dalam serum dianalisis untuk menerangi mekanismeacteoside. Selain itu, model in vitro HK-2 yang disebabkan oleh glukosa tinggi menilai keberkesananacteosidepada tikus db/db dengan penentuan tahap ekspresi laluan isyarat NADPH/ oksidase-TGF- / Smad.
2|BAHAN DAN KAEDAH
2.1|Bahan kimia dan instrumen
Acetonitril gred UPLC dibeli daripada Merck (Darmstadt, Jerman); asid formik dibeli daripada Sigma-Aldrich (Sigma, St. Louis, Missouri).Acteoside(Kemurnian Lebih daripada atau sama dengan 98 peratus ) telah dibeli daripada Institut Kawalan Makanan dan Dadah Kebangsaan (Beijing, China). Struktur yangacteosideditunjukkan dalam Rajah 1A. Kit reagen urea nitrogen (BUN) serum, kit reagen aspartate aminotransferase (GOT), kit reagen alanin aminotransferase (GPT), kit reagen jumlah kolesterol (TCHO), kit reagen trigliserida (TG), kit reagen kreatinin serum (Scr), mikroalbumin kencing (mALB) kit reagen dan kit reagen insulin (INS) telah dibeli dari Institut Bioengineering Nanjing Jiancheng (Nanjing, China). Tablet Metformin hidroklorida dibeli daripada Sino American Shanghai Squib Pharmaceutical Ltd; Irbesartan dibeli daripada Shenzhen Haibin Pharmaceutical Co., Ltd. DMEM dan F12 dibeli dari GIBCO, Amerika; NOX1 (nombor katalog: ab121009), NOX2 (nombor katalog: ab129068), NOX4 (nombor katalog: ab154244), dan Smad7 (nombor katalog: ab216428) antibodi pertama dibeli daripada Abcam (Cambridge, United Kingdom). -SMA (nombor katalog: 19245), E-cadherin (nombor katalog:3195), NF-κB p65 (nombor katalog: 8242), TGF- 1 (nombor katalog: 3711), Smad2 (nombor katalog: 5339) , Smad3 (nombor katalog: 9523), Smad4 (nombor katalog: 46535), dan PSmad2/3(nombor katalog: 8828) antibodi pertama dibeli daripada CST. Semua bahan kimia dan reagen lain yang digunakan dalam kajian ini adalah gred analitik dan dibuat di China.
Sistem Waters Acquity™ Ultra Performance LC (Waters) dilengkapi dengan spektrometer Quattro Micro MS dan Waters Xevo TM G2 QTof MS (Waters MS Technologies, Manchester, New Hampshire). Air ternyahion telah disucikan pada sistem Milli-Q (Millipore, Bedford, Massachusetts). Stesen kerja Mass Lynx v4.1 telah diterima pakai untuk menganalisis data, dan emparan berkelajuan ultra tinggi pada suhu rendah (Thermo Scientific, United Kingdom) dan mikroskop DMI3000M (Leica, Jerman) telah digunakan.
2.2|Keadaan eksperimen haiwan
Semua prosedur dan protokol eksperimen yang digunakan dalam kajian ini telah disemak dan diluluskan oleh Jawatankuasa Etika Haiwan Institusi Universiti Perubatan Cina Nanjing (Nanjing, China). Protokol yang diterangkan dalam kajian ini adalah selaras dengan garis panduan institusi untuk penjagaan dan penggunaan haiwan makmal. Tikus itu dibeli dari Pusat Penyelidikan Model Haiwan Universiti Nanjing (Sijil no. Su 2015–0001). Semua eksperimen telah dilakukan dengan 8-tikus db/db jantan berumur seminggu dan tikus jenis liar db/m jenis liar yang sepadan dengan berat badan awal 30 40 g. Model tetikus diabetes db/db ialah model haiwan diabetes yang diiktiraf di peringkat antarabangsa. Kajian telah menunjukkan bahawa mekanisme DKD dalam tikus db/db adalah serupa dengan manusia. Haiwan ditempatkan dalam sangkar dengan kelembapan malar (kira-kira 60 peratus ± 2 peratus ) dan suhu (kira-kira 23 ± 2 darjah ) dan dengan kitaran terang/gelap selama 12 jam. Haiwan itu menjalani tempoh penyesuaian selama 3 minggu, di mana mereka dibenarkan akses tanpa had ke air masak dan paip. Selepas tempoh penyesuaian, tikus db/db dibahagikan secara rawak kepada empat kumpulan dengan enam dalam setiap kumpulan: kumpulan model (normal saline, M), kumpulan metformin (250 mg kg-1 d-1, EJSG), kumpulan irbesartan (50 mg kg-1 d-1, EBST),acteosidekumpulan (70 mg kg-1 d-1, MRHTG), sekali sehari (Gao, Peng, Huo, Liu, & Yan, 2015). Selain itu, dalam kajian ini, metformin dan irbesartan dipilih sebagai ubat kawalan positif. Telah dilaporkan bahawa irbesartan boleh menurunkan tekanan darah, lipid darah, danlipid buah pinggang.Ia tidak mempunyai kesan ke atas glukosa darah dan lipid hati. Ia boleh meningkatkan fungsi dan perubahan patologibuah pinggangdaripada tikus db/db. Kesan perlindungan metformin padabuah pinggangdicerminkan dalam pengurangan proteinuria pada tikus diabetes dan pesakit diabetes jenis 2. Dos haiwan metformin dan irbesartan diekstrapolasi daripada dos harian manusia, menggunakan kaedah normalisasi kawasan permukaan badan. Kemudian, tikus diberi ubat yang sepadan sekali sehari dengan lavage gastrik selama 6 minggu, dan tikus db / m digunakan sebagai kumpulan kawalan, yang diberi jumlah garam yang sama pada masa yang sama.
2.3|Pengumpulan sampel
Semasa tempoh percubaan, berat badan dan tahap glukosa darah puasa (FBG) direkodkan setiap minggu, tahap FBG diukur dengan sistem pemantauan glukosa darah One Touch Ultra II (Life Scan, Milpitas, California) melalui urat ekor setiap hari Isnin (jam 8 pagi). ). Selepas 6 minggu pentadbiran, tikus telah berpuasa dalam sangkar metabolik dengan akses percuma kepada air untuk mengumpul air kencing 24 jam. Semua sampel air kencing segera disentrifugasi pada 3000 rpm selama 10 minit selepas pengumpulan, dan supernatan diasingkan dan disimpan pada -80 darjah sehingga analisis. Pada akhir kajian, tikus telah dikorbankan di bawah bius dengan 10 peratus kloral hidrat (3 mg/kg), dan darah dikumpulkan untuk kepekatan parameter biokimia dan kajian metabolomik. Kemudian, sampel darah telah disentrifugasi pada 3000 rpm selama 10 minit, dan sampel serum diasingkan dan disimpan pada -80 darjah sehingga analisis. Buah pinggang kanan dikeluarkan dengan satu keping tetap dengan 10 peratus formalin buffer neutral untuk pemeriksaan histologi. Thebuah pinggangkorteks telah diasingkan daripada bahagian lain dan dibekukan dalam nitrogen cecair untuk pembongkaran barat.
Cistanche untuk merawat kegagalan buah pinggang
2.4|Kultur dan rawatan sel
Talian RTEC manusia HK{{0}} diperolehi daripada Nanjing Keygen Biotechnology Development Co., Ltd. Medium yang lengkap ialah DMEM glukosa rendah dengan 10 peratus FBS dan 1 peratus larutan penisilin-streptomisin. Sel HK-2 telah dikultur dalam 37 darjah , 5 peratus CO2 dan kelembapan tepu. Sel-sel telah disubkultur pada pertemuan 80 peratus, yang dikeluarkan dari inkubator, dan medium asal dalam hidangan dibuang. Sel dibilas menggunakan 0.5 ml phosphate buffer saline (PBS) dan dicerna dengan rawatan dengan 0.5 ml trypsin selama 1-2 minit pada 37 darjah. Pencernaan telah ditamatkan menggunakan medium DMEM 2 ml, dan penggantungan sel kemudiannya disentrifugasi pada 450g selama 5 minit pada 4C. Supernatan dibuang dan sel-sel digantung semula dalam 2 ml medium DMEM yang sepadan untuk mendapatkan penggantungan sel tunggal. Sel telah disemai ke dalam hidangan/plat mikro yang berbeza pada ketumpatan yang berbeza untuk eksperimen seterusnya, seperti yang diterangkan di bawah. Sel HK-2 disalut pada 96-pinggan dan pinggan perigi, dirawat terlebih dahulu dengan glukosa rendah DMEM (5 mmol/L), diinkubasi pada suhu 37C dan 5 peratus CO2selama 6 jam, dan kemudian disegerakkan. Kumpulan eksperimen dibahagikan seperti berikut: kumpulan kawalan (C), tanpa faktor intervensi; kumpulan model (M), di mana sel dibiakkan dalam larutan DMEM glukosa tinggi (30 mmol/L); kumpulan kawalan tekanan osmotik (DMEM ditambah 24.5 mmol/L manitol, GLC); kumpulan irbesartan (25 mmol/L) danacteoside(MRHTG) pada lima dos (5, 10, 25, 50, dan 100 μmol/L), masing-masing.
2.5|Morfologi sel
Sel HK-2 telah dibasuh dua kali dengan PBS dan dilihat di bawah mikroskop terbalik (OLYMPUS IX51). Morfologi sel diperhatikan di bawah 100 pembesaran.
2.6|Pengukuran penunjuk biokimia
Keberkesanan terapeutik daripadaacteosidepada tikus db/db dinilai untuk tahap mALB dalam air kencing dan FBG, INS, T-CHO, TG, Scr, GOT, GPT, dan BUN dalam serum, yang dikesan diikuti dengan penerangan yang dibekalkan oleh pengilang kit.
2.7|Analisis patologi
Sebahagianbuah pinggangkorteks dilakukan untuk pewarnaan hematoxylin-eosin (HE) dan asid berkala-Schiff (PAS) untuk melihat perubahan patologi dalamtisu buah pinggang, darjah hiperplasia tisu fibrosis, struktur glomeruli dan tubul melalui mikroskop elektron (400). Apabila mengambil gambar, cuba penuhkan seluruh bidang penglihatan dengantisu buah pingganguntuk memastikan bahawa cahaya latar belakang setiap gambar adalah sama. Perisian Image-Pro Plus 6.0 telah digunakan untuk memilih warna merah-ungu yang sama seperti kriteria bersatu untuk menilai positif semua foto. Ketumpatan optik terkumpul (IOD) ekspresi positif membran bawah tanah dan kawasan piksel plexus vaskular glomerular (AREA) diperoleh dengan menganalisis setiap foto, dan purata ketumpatan optik (IOD/AREA) dikira.
2.8|Western blotting
Tisu buah pinggangdan sel telah diekstrak dengan penimbal lisis; lisat telah disentrifugasi. Selepas pirolisis penuh, sentrifuge selama 5 minit pada 12000 rpm, dan ambil supernatan dan supernatan dikumpulkan. Kit kepekatan protein asid Bicinchoninic (BCA) digunakan untuk menentukan kepekatan protein. Selepas kuantifikasi, protein telah diselesaikan oleh 10 peratus SDS-PAGE, dipindahkan ke membran PVDF, kemudian disekat dalam 5 peratus BSA dalam TBST, dan diinkubasi dengan antibodi primer diikuti oleh antibodi sekunder yang sepadan. Kereaktifan antibodi kemudiannya dikesan oleh ECL dan dikira dengan perisian ImageJ.Tisu buah pinggangsampel telah dianalisis dengan blotting barat untuk mengesan tahap ekspresi -SMA, TGF- 1 (1:1300), Smad2 (1:3000), Smad3 (1:1000), P-Smad2/3 (1:500 ), Smad4 (1:1000), dan Smad7 (1:1000) protein.
2.9|analisis ELISA
Rembesan monocyte chemoattractant protein -1 (MCP-1), interleukin –1 (IL-1 ), tumor necrosis factor- (TNF-), dan interleukin-6 (IL -6) dalam supernatan setiap sel diukur dengan kit ELISA.
2.10|PCR masa nyata
Selain itu, sel-sel ini disediakan untuk PCR masa nyata untuk memeriksa tahap ekspresi NOX1, NOX2, NOX4, -SMA, E-cadherin, NF-κB p65, TGF- 1, Smad2, Smad3, Smad4 dan Smad7 mRNA. Sel dalam setiap kumpulan (kira-kira 1 107 sel) telah dikumpulkan. Jumlah RNA telah diekstrak mengikut kaedah satu langkah Trizol, dan ketulenan dan kepekatannya ditentukan. Dengan GAPDH sebagai rujukan dalaman, urutan primer adalah seperti berikut. TGF- 1, primer deria: 5-ACACATCAGAGCTCCGAGAA-3, primer antisense: 5-GAGGTATC GCCAGGAATTGT-3;E-cadherin, primer deria: 5- ACGCATTGCCA CATACACTC-3, primer antisens: 5-GGTGAATTCGGGCTTGTTGT-3; NF-κB p65, primer deria: 5-CTTCCTGCCCTACAGAGGTC-3, primer antisense: 5-AGAGCAAGGAAGTCCCAGAC-3;NOX1, primer deria: 5-CCTAGAAGGGCTCCAAACCA{{33} }, primer antisense: 5-GGAAGGCATCCACAAACAGG-3; NOX2, primer deria: 5-ACCCTTCGCATCCATTCTCA-3, primer antisense: 5-TCTGCAAACCACTCAAAGGC-3; NOX4, primer deria: 5-CAAGCAGGAGAACCAGGAGA-3, primer antisens: 5-AGTTGAGGGCATTCACCAGA-3; Smad2, primer deria: 5-TGAGCACGTGAGGTGAGATT-3, primer antisense: 5-CTCCATCACAGTGCACCAAG-3; Smad3, primer deria: 5-CAGCCGGTTTGGATTACAGG-3, primer antisense: 5-GAGTCAAAGTCCCTGCTTCCT-3; Smad4, primer deria: 5-CACTGCCAACTTTCCCAACA-3, primer antisense: 5-ATCCATTCTGCTGCTGTCCT-3; Smad7, primer deria: 5-AAGAGTCAGCTGGTGCAGAA-3, primer antisense: 5-GCGGACTTGATGAAGATGGG-3; -SMA, primer deria: 5-GGTGCTGTCTCTCTATGCCT-3, primer antisens: 5-CAGATCCAGACGCATGATGG-3; GAPDH, primer deria: 5-TGGTATCGTGGAAGGACTCA-3, primer antisens: 5-CCAGTAGAGGCAGGGATGAT-3.
2.11|Analisis statistik
Data dan analisis statistik mematuhi cadangan reka bentuk eksperimen dan analisis dalam farmakologi. Semua eksperimen adalah rawak dan buta. Keputusan dinyatakan sebagai M ± SD/SEM bagi nombor (n) yang ditunjukkan bagi eksperimen bebas. Data dalam kajian semasa dibentangkan sebagai M ± SD/SEM daripada sekurang-kurangnya tiga eksperimen bebas. Kepentingan perbezaan dianalisis dengan ANOVA sehala diikuti dengan ujian Tukey (lebih daripada dua kumpulan) atau ujian-t Pelajar (dua kumpulan). Ujian post hoc dilakukan hanya apabila F mencapai p < .05,="" dan="" tidak="" terdapat="" ketidakhomogenan="" varians="" yang="" ketara.="" semua="" ujian="" adalah="" dua="" belah,="" dan="" p=""><.05 dianggap="" signifikan="" secara="" statistik.="" analisis="" statistik="" dilakukan="" menggunakan="" perisian="" graphpad="" prism="">
Cistanche acteoside untuk memperbaiki buah pinggang
2.12|Keadaan dan analisis data UPLC-QTOF/MS
Semua sampel serum dicairkan pada suhu bilik sebelum penyediaan. 300 ul asetonitril telah ditambah kepada 100 ul sampel serum kepada protein termendak, dan dicampur dengan kuat selama 60 saat. Semua sampel telah disentrifugasi pada 13000 rpm selama 10 minit pada 4 darjah . Akhirnya, supernatan disuntik ke dalam analisis UPLC-QTOF/MS. Pengasingan metabolit dilakukan menggunakan sistem Waters Acquity™ Ultra Performance LC (Waters) yang dilengkapi dengan Waters Xevo™ G2 Q/TOF-MS (Waters MS Technologies). Alikuot 2 ul larutan sampel disuntik pada Acquity UPLC BEH C18 (100 mm 2.1 mm, 1.7 μm, Waters Corporation, Milford, Connecticut) pada 35 darjah dan kadar alir ialah 0.4 ml/min. Fasa bergerak optimum terdiri daripada air (A) (mengandungi 0.1 peratus asid formik) dan asetonitril (B). Keadaan elusi UPLC yang dioptimumkan untuk analisis serum ialah 0 3 min, 95 peratus 55 peratus A; 4 13 min, 55 peratus 5 peratus A; 13 14 min, 5 peratus A. Autosampler dikekalkan pada 4 darjah .
Spektrometri jisim dilakukan menggunakan Xevo™ G2 QTof (Waters MS Technologies), quadrupole, dan pecutan ortogonal time-of-flight mass trometer. Leucine-enkephalin digunakan sebagai jisim kunci yang menjana [M tambah H]tambah lagiion (m/z 556.2771) dan [MH]-ion (m/z 554.2615) dalam mod positif dan negatif, masing-masing. Kepekatan leucine-enkephalin ialah 200 pg/ml dan kadar aliran infusi ialah 100 ul/min untuk memastikan ketepatan semasa analisis MS melalui pam picagari. Data dikumpul dalam mod centroid dari 100 hingga 1,000 m/z. Untuk kedua-dua mod elektrospray positif dan negatif, voltan kapilari dan kon ditetapkan pada 3.0 kV dan 30 V, masing-masing. Gas pelarutan ditetapkan kepada 600 L/jam pada suhu 350 darjah, gas kon ditetapkan kepada 50 L/jam dan suhu punca ditetapkan kepada 120 darjah. Kadar pemerolehan data ditetapkan kepada 30 ms, dengan kelewatan interscan 0.02 s.
Selain itu, 10 sampel serum telah dipilih secara rawak daripada setiap kumpulan dan masing-masing dicampurkan sebagai sampel kawalan kualiti (QC). Sampel QC digunakan untuk mengoptimumkan keadaan UPLCQTOF/MS, kerana ia mengandungi kebanyakan maklumat keseluruhan sampel. Sampel QC telah disuntik enam kali pada permulaan larian untuk mengkondisikan atau mengimbangi sistem dan kemudian setiap 10 sampel untuk memantau kestabilan analisis. Setiap hari, selepas instrumen ditentukur, sampel QC dianalisis terlebih dahulu untuk menguji kestabilan instrumen bagi memastikan prestasi sistem yang konsisten.
Semua pemerolehan data dan analisis data dikawal oleh perisian Waters MassLynx v4.1. Matriks data berbilang variasi telah dianalisis oleh perisian EZinfo 2.0 (Waters Corp.). Parameter utama termasuk julat masa pengekalan 0 14 min; nisbah jisim m/z 100 1,000, julat toleransi jisim 0.{{10}}1 Da, ambang keamatan puncak 50, tetingkap kualiti 0.05 Da, pengekalan tetingkap masa 0.20 min, dan pengesanan automatik 5 peratus ketinggian puncak dan bunyi. Keamatan setiap ion telah dinormalkan berkenaan dengan jumlah kiraan ion untuk menghasilkan matriks data yang terdiri daripada masa pengekalan, nilai m/z dan kawasan puncak ternormal.
Matriks data yang terhasil telah diperkenalkan kepada perisian EZinfo 2.0 untuk analisis komponen utama, analisis diskriminasi kuasa dua separa (PLS-DA) dan analisis unjuran ortogon kepada struktur pendam (OPLS-DA). Daripada OPLS-DA, pelbagai metabolit boleh dikenal pasti sebagai bertanggungjawab untuk pemisahan antara kumpulan kawalan dan kumpulan model dan oleh itu dilihat sebagai penanda berpotensi. Penanda minat yang berpotensi diekstrak daripada plot-S yang dibina berikutan analisis dengan OPLS-DA, dan pembolehubah yang mempunyai sumbangan penting kepada diskriminasi antara kumpulan tertakluk kepada pengenalpastian lanjut formula molekul.
Kepentingan pembolehubah (VIP) dalam nilai unjuran ialah jumlah wajaran kuasa dua bagi pemberat PLS, dan pembolehubah dengan VIP > 1 dianggap berpengaruh untuk pengasingan sampel dalam plot skor yang dijana daripada analisis OPLS-DA. Dalam semua percubaan, tahap keyakinan ditetapkan pada 95 peratus untuk menentukan kepentingan perbezaan (p < .05).="" pembolehubah="" tersebut="" akhirnya="" dipilih="" sebagai="" biomarker="" yang="" berpotensi.="" plot="" skor="" pls-da="" diterangkan="" oleh="" parameter="" pengesahan="" silang="" r2y="" dan="" q2,="" yang="" mewakili="" jumlah="" variasi="" yang="" dijelaskan="" untuk="" matriks="" x="" dan="" kebolehramalan="" model,="" masing-masing.="" model="" cemerlang="" diperoleh="" apabila="" nilai="" kumulatif="" r2y="" dan="" q2="" melebihi="" 0.8.="" jarak="" relatif="" antara="" kumpulan="" pentadbiran="" dan="" kumpulan="" kawalan="" dari="" plot="" skor="" pls-da="" dikira="" dengan="" nilai="" purata="" (paksi-x="" dan="" paksi-y)="" semua="" sampel="" kumpulan="" kawalan="" sebagai="" titik="">
Metabolit berpotensi yang dipilih telah dikenal pasti mengikut penentuan m/z yang tepat, masa pengekalan, dan serpihan dan corak MS/MS tipikal bagi biomarker berpotensi di atas, yang diperoleh dalam mod ion positif dan negatif. Pembinaan laluan metabolik dilakukan dengan Metabo Analyst, yang merupakan alat berasaskan web untuk visualisasi metabolomik (https://www. metaboanalyst.ca/) berdasarkan sumber pangkalan data termasuk KEGG (HTTP:// www.genome .jp/kegg/) dan pangkalan data HMDB (http://www.hmdb. ca/) untuk carian. Masa pengekalan dan serpihan dan corak MS/MS biasa mempunyai banyak manfaat untuk mengecilkan julat molekul yang mungkin.
Acteoside dalam Cistanche boleh Meningkatkan Fungsi Buah Pinggang
3|KEPUTUSAN
Klik di sini untuk mendapatkan maklumat tentang Bahagian II (hasil) artikel ini.
Dipetik daripada: ' Produk semulajadi daripadaacteosidemembaikikecederaan buah pinggangdalam tikus diabetes db/db dan sel HK-2 melalui mengawal selia laluan isyarat NADPH/ oksidase-TGF- /Smad' -----oleh Qinwen Wang|Xinxin Dai et.al
----Penyelidikan Fitoterapi. 2021;35:5227–5240. wileyonlinelibrary.com/journal/ptr © 2021 John Wiley & Sons Ltd. DOI: 10.1002/ptr.7196
