Acteoside Sebagai Pilihan Terapeutik Berpotensi Untuk Karsinoma Hepatoselular Utama: Kajian Praklinikal

Hubungi: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mel:audrey.hu@wecistanche.com

Di Ma , Juan Wang , Lu Liu , Meiqi Chen dan Zhiyong Wang

Abstrak

Latar Belakang: Karsinoma hepatoselular (HCC) adalah tumor malignan biasa dengan ciri prognosis yang buruk, morbiditi tinggi, dan kematian di seluruh dunia. Khususnya, hanya beberapa pilihan rawatan sistemik yang tersedia untuk pesakit HCC lanjutan dan termasuk sorafenib dan rejimen atezolizumab ditambah bevacizumab yang diterangkan baru-baru ini sebagai rawatan lini pertama yang mungkin. Kami di sini mencadangkan acteoside, glikosida phenylethanoid yang diedarkan secara meluas dalam banyak tumbuhan ubatan sebagai calon yang berpotensi menentang HCC lanjutan.

Kaedah: Percambahan sel, pembentukan koloni dan penghijrahan telah dianalisis dalam tiga garisan sel HCC manusia BEL7404, HLF dan JHH-7. Ujian angiogenesis dilakukan menggunakan HUVESs. Model tikus bogel xenograf BEL7404 atau JHH{3}} telah ditubuhkan untuk menganalisis kemungkinan kesan antitumor acteoside. qRT-PCR dan western blotting digunakan untuk mendedahkan potensi mekanisme antitumor acteoside.

Keputusan:Acteoside daripada cistanchemenghalang pembiakan sel, pembentukan koloni dan penghijrahan dalam ketiga-tiga garisan sel HCC manusia BEL7404, HLF dan JHH-7. Larangan angiogenesis oleh acteoside telah didedahkan oleh perencatan pembentukan tiub dan penghijrahan sel HUVECs. Gabungan acteoside dan sorafenib menghasilkan perencatan yang lebih kuat terhadap pembentukan koloni sel dan penghijrahan sel HCC serta angiogenesis HUVEC. Keberkesanan antitumor in vivo acteoside telah ditunjukkan selanjutnya dalam model tikus bogel xenograft BEL7404 atau JHH-7, dengan peningkatan apabila digabungkan dengan sorafenib dalam menghalang pertumbuhan JHH-7 xenograf. Rawatan lanjut sel JHH-7 dengan acteoside mendedahkan peningkatan dalam tahap protein penindas tumor p53 serta penurunan tahap gen peptidase berkaitan kallikrein (KLK1, 2, 4, 9, dan 10) tanpa ketara. perubahan gen KLK1-15 yang lain.

Kesimpulan:Acteoside daripada cistanchememberikan kesan antitumor mungkin melalui pengawalseliaan tahap p53 serta perencatan ekspresi KLK dan angiogenesis. Acteoside boleh berguna sebagai tambahan dalam rawatan HCC lanjutan di klinik.

Kata kunci: Acteoside, Karsinoma hepatoselular, Sorafenib, Xenograf, p53, Kallikrein

Latar belakang

Karsinoma hepatoselular (HCC) adalah tumor malignan biasa dengan ciri-ciri prognosis yang buruk dan morbiditi dan kematian yang tinggi di seluruh dunia [1, 2]. Pelbagai faktor telah dikenalpasti menyumbang kepada kejadian dan perkembangan HCC, termasuk jangkitan oleh virus hepatitis B atau C, penyahaktifan gen penindas tumor seperti p53, pengaktifan abnormal onkogen seperti K-ras, dan beberapa molekul isyarat. seperti PI3K, ERK/MAPK, dan Wnt/ -catenin serta pengelakan sistem imun hos [3, 4]. Untuk pengurusan HCC, reseksi, pemindahan hati dan ablasi frekuensi radio adalah pilihan untuk pesakit HCC peringkat awal, namun dengan kadar berulang dan metastasis yang tinggi [3, 5, 6]. Di samping itu, hanya beberapa pilihan rawatan sistemik yang tersedia untuk pesakit HCC lanjutan dan termasuk sorafenib dan rejimen atezolizumab ditambah bevacizumab baru-baru ini sebagai rawatan lini pertama yang mungkin [7]. Dalam konteks ini, adalah penting dan menarik untuk sama ada membangunkan ejen baharu yang menyasarkan pelbagai sasaran molekul atau menetapkan strategi baharu seperti penggunaan terapi gabungan dalam rawatan HCC lanjutan.

Acteoside daripada cistancheadalah glikosida phenylethanoid yang diedarkan secara meluas dalam banyak tumbuhan ubatan, termasuk Ligustrum purpurascens [8], Rehmannia glutinosa [9], dan Ligustrum purpurascens [10]. Bukti pemasangan telah menunjukkan bahawa acteoside boleh melakukan pelbagai aktiviti biologi, termasuk aktiviti antitumornya. Sebagai contoh, acteoside menunjukkan kesan antiproliferatif yang kuat pada sel-sel kanser prostat [11]. Penghantaran intraperitoneal acteoside menindas pertumbuhan tumor dalam model tetikus melanoma mungkin melalui menghalang protein kinase C [12]. Selain itu, acteoside mempotensikan pemekaan sel kanser kolorektal kepada 5- Fluorouracil melalui penyasaran isyarat PI3K/Akt [13]. Data terdahulu kami juga telah menunjukkan perencatan melanogenesis oleh acteoside dalam sel melanoma B16 [14]. Walaupun begitu, sedikit maklumat tersedia mengenai kemungkinan keberkesanan acteoside dalam rawatan HCC dan potensi mekanisme asas.

Dalam kajian ini, kami telah menunjukkan bahawaActeoside daripada cistanchemenghalang percambahan sel, pembentukan koloni, dan penghijrahan dalam ketiga-tiga garisan sel HCC manusia BEL7404, HLF dan JHH7. Angiogenesis juga dihalang selepas rawatan dengan acteoside, seperti yang ditunjukkan oleh perencatan pembentukan tiub dan penghijrahan sel HUVECs. Keberkesanan antitumor in vivo acteoside ditunjukkan lagi dalam model tikus bogel xenograf BEL7404 atau JHH-7, dengan peningkatan apabila digabungkan dengan sorafenib dalam menghalang pertumbuhan JHH-7 xenograf. Kesan antitumor acteoside boleh dikaitkan dengan pengawalseliaan p53 serta penindasan KLK dan angiogenesis.

Kaedah

Kultur sel

Talian sel karsinoma hepatoselular manusia (HCC) BEL7404, HLF, dan JHH7 diperoleh daripada Koleksi Budaya Jenis Amerika dan secara rutin dikultur dalam medium DMEM yang mengandungi 10 peratus serum lembu janin ditambah dengan 100 unit/ml penisilin G dan 100 ug/ml streptomycin dalam inkubator lembap pada 37 darjah dengan 5 peratus karbon dioksida. Sel endothelial vena umbilical manusia (HUVECs) telah diasingkan daripada urat tali pusat manusia (disediakan oleh ScienCell Research Laboratories, San Diego, Amerika Syarikat) dan dikekalkan dalam medium sel endothelial seperti yang diterangkan sebelum ini [15].

ReagenActeoside daripada cistanche (A01) telah dibeli daripada Jiangsu Yongjian Medicine Technology Co., Ltd. (Taizhou, China; Lot No. 100581; Ketulenan Lebih Besar daripada atau sama dengan 99 peratus oleh HPLC). Sorafenib diperoleh daripada Selleck Chemicals (Houston, USA). Kami melarutkan acteoside dalam 0.9 peratus salin. Penyelesaian stok sorafenib disediakan dalam dimetil sulfoksida (DMSO; 10 mM), diasingkan, dan disimpan pada -20 darjah.

Haiwan

Tikus BALB/c (Nu/Nu) jantan (18-20 g, 6–8 minggu pada masa penerimaan) telah digunakan dalam kajian (Shanghai Slac Laboratory Animal Co. Ltd., Shanghai, China). Haiwan telah ditempatkan dalam sangkar polysulfone yang berventilasi secara individu dalam bilik yang dikawal suhu dan cahaya (kitaran gelap 12 jam- 12 jam, lampu dinyalakan pada 7:00 pagi) dengan akses percuma kepada makanan dan air . Semua protokol eksperimen telah diluluskan oleh Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Institusi dan dilakukan mengikut garis panduan Persatuan Antarabangsa untuk Kajian Sakit mengenai penggunaan haiwan makmal.

Ujian percambahan sel Aktiviti anti-proliferatif dilakukan menggunakan ujian MTT. Secara ringkasnya, sel disalut pada ketumpatan 4– 5 × 103 sel setiap telaga dalam 96-plat perigi. Selepas dilampirkan semalaman, sel dirawat dengan satu siri kepekatan acteoside. Mengikuti rawatan ubat pada titik masa yang dinyatakan, sel diinkubasi dengan 3-(4,5- Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT ; Roche Diagnostic Corporation, Indianapolis, IN, Amerika Syarikat. Kepekatan akhir:5 ug/ml) selama 3–4 jam pada 37 darjah . Produk formazan telah dibubarkan dalam DMSO untuk kuantiti pada panjang gelombang 570 nm.

Colony formation assay Cells were seeded in 24-well plates at a density of 200 cells per well and allowed to attach to the bottom of the well overnight. Cells were then treated with indicated drugs at the given concentration. The culture medium was replaced every 3 days until colonies were visible on day 12 post-culturing. For colonies counting, the cells were fixed with 4% paraformaldehyde and stained with 0.1% crystal violet. Colonies>10 sel telah dikira di bawah mikroskop cahaya (x 100 pembesaran; Olympus, Tokyo, Jepun).

Ujian penyembuhan luka Sel-sel telah disemai dalam {{0}}plat perigi (1 × 105 sel setiap perigi) dan dikultur hingga 90 peratus pertemuan. Lapisan sel dicakar dengan hujung pipet steril 200 ul untuk menghasilkan celah luka. Penghijrahan sel ke kawasan yang cedera divisualisasikan pada titik masa yang ditunjukkan (0, 10, dan 24 jam) di bawah mikroskop cahaya terbalik pada pembesaran × 100. Setiap eksperimen dilakukan dalam tiga kali ganda.

Ujian pembentukan tiub HUVEC telah dibiakkan seperti yang diterangkan sebelum ini [15]. Ringkasnya, 96-plat perigi disalut dengan Matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, USA) mengikut arahan pengilang dan kemudian dikembalikan ke inkubator untuk mempolimerkan selama 30–40 minit. HUVEC kemudiannya disemai pada ketumpatan 2 × 105 sel / mL dan dirawat dengan pelbagai ubat yang diberikan selama 8 jam. Pembentukan tiub telah difoto dengan mikroskop terbalik pada titik masa yang ditunjukkan dan dianalisis menggunakan perisian ImageJ.

Analisis Western blotting

Jumlah lisat sel telah disediakan dengan penimbal ujian radioimunopresipitasi (RIPA) (50 mM Tris HCl pada pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 peratus NP40, 1 peratus natrium deoksikolat, 0.1 peratus SDS, 10 ug/ml leupeptin, 10 ug/ml aprotinin dan 2 mM PMSF). Sampel protein dengan jumlah yang sama (20 ug/lorong) diasingkan pada gel SDS-PAGE dan dipindahkan ke membran PVDF (Bio-Rad, Hercules, CA). Membran diinkubasi semalaman dengan antibodi p53 (Cell Signaling Technology, Boston, MA). Untuk kawalan pemuatan, membran telah dibilas dengan penimbal pelucutan dan disapu dengan antibodi -actin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Protein dikesan menggunakan sistem pengesanan ECL (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, USA).

qRT-PCR

Jumlah RNA telah diekstrak daripada garisan sel menggunakan reagen Trizol (Invitrogen, Amerika Syarikat) dan menjalani tindak balas rantai transkripsi-polimerase terbalik (RT-PCR) untuk mensintesis cDNA menggunakan kit yang tersedia secara komersial. qRT-PCR masa nyata menggunakan qPCR Supermix hijau 2xSYBR telah dijalankan pada mesin Stratagene Mx3000P PRC (Agilent Technologies, USA). Urutan primer ditunjukkan di bawah: deria 5′-CACCATGTGG TTCCTGGTTC-3′ dan anti-deria 5′- CAAACAAGTT GTGGCGACCC-3′ untuk KLK1; rasa 5′-GTGTACAGTC ATGGATGGGC-3′ dan anti-rasa 5′-CCCAGAATCA CCCCCACAAG-3′ untuk KLK2; deria 5′- CCACACCC GCTCTACGATATGA-3′ dan anti-sense 5′-CCC AGA ATCACCCGAGCAG-3′ untuk KLK3; deria 5′-CGCACA CTGTTTCCAGAACTC-3′ dan anti-deria 5′- GTTG CAGGAGTCCTTCTGGT-3′ untuk KLK4; deria 5′-CCTG CACCCACATCTTTCTCT-3′ dan anti-deria 5′- GGTAAGCATCCTCGCACCTT-3′ untuk KLK5; deria 5′- CTCTCTCCTGGGGACACAGA-3′ dan anti-deria 5′- TCCGCCATGCACCAACTTAT-3′ untuk KLK6; deria 5′- TTTGGAGCCCAGCTGTGTG-3′ dan anti-deria 5′- GTCACCATTGCAGGCGTTTT-3′ untuk KLK7; deria 5′- CTGGGCAGGACACTCCAG-3′ dan anti-deria 5′- ACCCCGCCACAGAGTAGTTG-3′ untuk KLK8; deria 5′- GTAGGGGGTTCTCGTAGGGT-3′ dan anti-deria 5′- CGGTGACGTCATAGAGACGG-3′ untuk KLK9; deria 5′-CAGGAGTGCCAGCCTCAC-3′ dan anti-deria 5′- CTGGGGAGGAAGAGGATGGA-3′ untuk KLK10; rasa 5′-CCCCCCCCTTGGATTCTGTCT-3′ dan anti-rasa 5′-GTGAACTATGTAGCGGGGCT-3′ untuk KLK11; deria 5′-TGTTTCTGGTGAGTTCTCCCG-3′ dan anti-sense 5′-GGATCCAGTCCACATACTTGC-3′ untuk KLK12; rasa 5′-CCTGAACCACGACCATGACA-3′ dan anti-deria 5′-GCAGGGTTTGGATGTAGCCT-3′ untuk KLK13; rasa 5′-CCCAACTACAACTCCCGGAC-3′ dan anti-rasa 5′-CCTGAAGCAACTGCTCGTGA-3′ untuk KLK14; deria 5′-AGTTGCTGGAAGGTGACGAG- 3′ dan anti-deria 5′-TGGCTAACATCTGGGCCTTG- 3′ untuk KLK15; deria 5′-GACAGTCAGCCGCATCTT CT-3′ dan anti-deria 5′- GCGCCCAATACGACCAAA TC-3′ untuk GAPDH. Nilai ambang kitaran (Ct) setiap gen KLK telah dinormalisasikan kepada GAPDH dan dianalisis dengan perisian MxPro.

Aktiviti antitumor in vivo A01 sahaja atau digabungkan dengan sorafenib Suspensi sel BEL7404 telah disediakan (3 × 106 sel) dan disuntik secara subkutan ke dalam rusuk kanan tikus bogel athymic. Sepuluh hari selepas inokulasi, tikus pembawa tumor (berat badan(g):22–26; min ± SEM:23.8 ± 0.14) telah disaring dan dipilih untuk rawak kepada 7 kumpulan rawatan berikutan jumlah tumor ({ {12}} mm3 ). Sebanyak 38 tikus telah diperuntukkan kepada kumpulan rawatan yang berbeza (n=5 setiap kumpulan kecuali untuk kumpulan model (n=8)). Haiwan kemudian dirawat melalui gavage oral dengan acteoside (A01; 12.5, 25 dan 50 mg/kg), sorafenib sahaja (50 mg/kg) atau digabungkan dengan A01 (50 mg/kg) sekali sehari selama 14 hari. Selain itu, dos 20 mg/kg A01 juga dihantar secara intravena. Dos dipilih berdasarkan kajian terdahulu dan data awal kami [15]. Pertumbuhan tumor dipantau setiap 3 atau 4 hari menggunakan angkup elektronik, dengan volum dikira sebagai 0.5xlengthxwidth (mm3 ). Selain itu, percubaan selari menggunakan inokulasi JHH{34}} telah disertakan. Tujuh hari selepas inokulasi, tikus pembawa tumor (berat badan(g):20–26; min ± SEM:24.0 ± 0.20) disaring dan dipilih untuk rawak ke dalam kumpulan rawatan mengikut volum tumor (80-130 mm3 ). Sebanyak 23 tikus telah diperuntukkan kepada 4 kumpulan rawatan (n=5 setiap kumpulan kecuali untuk kumpulan model (n=8)). Haiwan kemudian menerima A01 (20 mg/kg, iv), sorafenib sahaja (50 mg/kg, ig) atau digabungkan dengan A01 (20 mg/kg, iv) sekali sehari selama 14 hari berturut-turut. Semua tikus telah dibius dengan chloral hydrate (350 mg/kg) dan dikorbankan dengan dislokasi leher pada akhir tempoh pemerhatian. Dan jisim tumor telah dikeluarkan dan digambarkan dengan kamera digital.

Analisis statistik

Semua data dinyatakan sebagai min ± sisihan piawai (SD). Melainkan dinyatakan sebaliknya, analisis statistik dilakukan menggunakan analisis varians (ANOVA) diikuti dengan ujian Tukey posthoc. Nilai isipadu tumor ditunjukkan sebagai min ± ralat piawai min (SEM). ANOVA dua hala diikuti dengan ujian Tukey digunakan untuk menganalisis data volum tumor. Perisian GraphPad Prism digunakan untuk analisis statistik. Nilai p < 0.05="" dianggap="" signifikan="" secara="">

Keputusan

Kesan A01 pada pembiakan dan pembentukan koloni HCC secara in vitro

Tiga garisan sel HCC (BEL7404, HLF, dan JHH7) digunakan untuk ujian proliferasi sel. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1, ujian MTT mendedahkan bahawa A01 menghalang percambahan ketiga-tiga sel HCC. Untuk bertanya lagi sama ada aktiviti antiproliferatif A01 adalah disebabkan oleh keupayaannya menghalang klonogenisiti sel, ujian pembentukan koloni telah dilakukan. A01 pada 100 μM menunjukkan perencatan kuat pembentukan koloni dalam sel BEL7404 (Rajah 2a dan b). Apabila digabungkan dengan sorafenib (2 μM), potensi perencatan adalah lebih kuat daripada A01 atau sorafenib sahaja. Keputusan yang sama juga dilihat dalam dua sel HCC yang lain, HLF dan JHH-7 (Rajah 2c dan d).

Kesan A01 sahaja atau digabungkan dengan sorafenib pada penghijrahan sel HCC secara in vitro

Kami seterusnya menilai penghijrahan sel dengan menggunakan ujian luka calar. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3, gabungan A01 (100 atau 500 μM) dan sorafenib (10 μM) dengan ketara menghalang penyembuhan luka dalam ketiga-tiga sel HCC, jika dibandingkan dengan kumpulan kawalan. Untuk sel BEL7404, kedua-dua A01 (100 atau 500 μM) dan sorafenib (10 μM) hanya menghasilkan kecenderungan pencegahan penyembuhan luka tanpa kepentingan statistik (Rajah 3a dan d). Untuk sel HLF, A01 pada 500 μM dan sorafenib pada 10 μM menghalang penyembuhan luka. Khususnya, A01 (500 μM) digabungkan dengan sorafenib (10 μM) menghasilkan perencatan penyembuhan luka yang lebih kuat daripada sorafenib sahaja (Rajah 3b dan e). Untuk sel JHH, penyembuhan luka dihalang oleh A01 (500 μM) dan sorafenib (10 μM). Gabungan A01 (100 μM) dan sorafenib (10 μM) menghasilkan perencatan penyembuhan luka yang lebih kuat daripada A01 (100 μM) atau sorafenib (10 μM) sahaja. Selain itu, A01 pada 500 μM digabungkan dengan sorafenib (10 μM) menunjukkan perencatan penyembuhan luka yang lebih kuat daripada A01 (500 μM) atau sorafenib (10 μM) sahaja (Rajah 3c dan f).

Kesan A01 sahaja atau dalam kombinasi dengan sorafenib pada angiogenesis in vitro

Angiogenesis berkait rapat dengan pertumbuhan tumor, perkembangan, dan metastasis [16], dan dengan itu dianggap sebagai salah satu sasaran campur tangan untuk rawatan kanser. Kami mula-mula melakukan ujian pembentukan tiub untuk menganalisis potensi angiogenesis in vitro. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 4, rawatan selama 3 jam dengan sorafenib sahaja (10 μM) atau gabungan A01 (100 dan 500 μM) dan sorafenib (10 μM) mula menunjukkan kesan perencatan pada pembentukan struktur seperti vesel, iaitu. pemanjangan dan penjajaran HUVEC (Rajah 4a dan c). Selepas rawatan selama 8 jam, A01 (100 dan 500 μM), sorafenib (10 μM) serta gabungan A01 dan sorafenib semuanya menghalang dengan ketara pembentukan struktur seperti kapal, dengan perencatan yang lebih kuat oleh gabungan A01 dan sorafenib daripada A01 atau sorafenib sahaja (Rajah 4a dan c). Di samping itu, penghijrahan sel HUVEC adalah langkah utama untuk membentuk saluran baru semasa angiogenesis dan dengan itu disiasat. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 4b dan d, A01 (500 μM), sorafenib (10 μM) serta gabungan A01 (100 dan 500 μM) dan sorafenib (10 μM) semuanya menghalang penghijrahan sel HUVEC dengan ketara. A01 (500 μM) digabungkan dengan sorafenib (10 μM) menghasilkan perencatan yang lebih kuat daripada A01 (500 μM) atau sorafenib (10 μM) sahaja.

Kesan A01 sahaja atau digabungkan dengan sorafenib pada pertumbuhan tumor in vivo xenograf BEL7404 dan JHH-7 HCC

Untuk menilai lebih lanjut keberkesanan A01 sahaja atau digabungkan dengan sorafenib pada pertumbuhan tumor in vivo HCC, kami mewujudkan model tetikus bogel xenograf subkutan menggunakan BEL7404 atau JHH-7 sel. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 5, volum tumor telah berkurangan dengan banyaknya selepas rawatan dengan A01 (25 dan 50 mg/kg, melalui gavage oral; 20 mg/kg, melalui urat ekor; semua p <0.01 vs="" kumpulan="" model)="" atau="" sorafenib="" (50="" mg/kg,="" melalui="" gavage="" oral;="" p=""><0.01 vs="" kumpulan="" model)="" sahaja="" (rajah="" 5a="" dan="" b).="" gabungan="" a01="" (50="" mg/kg)="" dan="" sorafenib="" (50="" mg/kg)="" menunjukkan="" perencatan="" yang="" lebih="" kuat="" terhadap="" pertumbuhan="" tumor="" jika="" dibandingkan="" dengan="" sorafenib="" sahaja="" (p=""><0.01), tetapi="" menghasilkan="" kesan="" yang="" sama="" seperti="" a01="" sahaja="" (rajah="" 5a="" dan="" c).="" ).="" kami="" seterusnya="" menggunakan="" model="" tikus="" bogel="" xenograft="" jhh-7="" untuk="" menguji="" lebih="" lanjut="" kemungkinan="" keberkesanan="" anti-tumor="" a01.="" seperti="" yang="" ditunjukkan="" dalam="" rajah="" 6,="" rawatan="" dengan="" a01="" (20="" mg/kg,="" iv)="" atau="" sorafenib="" (50="" mg/="" kg,="" ig)="" menghasilkan="" perencatan="" ketara="" pertumbuhan="" tumor="" jhh-7="" xenograf="" (p="">< 0.01="" vs="" kumpulan="" model="" ),="" dengan="" perencatan="" yang="" lebih="" besar,="" apabila="" digabungkan="" bersama="" (rajah="" 6a="" dan="" b;="" p=""><0.01 vs="" a01="" atau="" kumpulan="" sorafenib="">

Kemungkinan modulasi peptidase berkaitan kallikrein dan p53 olehActeoside daripada cistanche

Peptidase berkaitan kallikrein (KLK) telah dicadangkan sebagai biomarker kanser dalam diagnosis dan prognosis pelbagai jenis kanser, termasuk karsinoma hepatoselular disebabkan oleh ekspresi disregulasi [17-19]. Dalam senario ini, kami mengesan ekspresi gen KLK1–15 dalam barisan sel HCC JHH-7. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 7, rawatan dengan acteoside menghasilkan perencatan ketara tahap mRNA KLK1, 2, 4, 9, dan 10 (Rajah 7a-e), tanpa perubahan ketara bagi KLK1-15 yang lain (data tidak ditunjukkan ). Di samping itu, kami juga mengesan tahap protein penindas tumor p53 dan mendedahkan peningkatan dengan rawatan dengan acteoside (Rajah 7f).

Perbincangan

Pengurusan HCC lanjutan telah lama sukar dikawal kerana ketidakupayaan diagnosis pada peringkat awal dan kemoresistance tumor [5, 6]. Sorafenib, perencat multikinase dilaporkan menghalang percambahan sel dan angiogenesis, bersama-sama dengan lenvatinib perencat multi-kinase oral yang lain telah menjadi rawatan standard HCC lanjutan [3, 5, 20, 21]. Walau bagaimanapun, kadar kelangsungan hidup keseluruhan adalah sederhana memandangkan kadar tindak balas yang rendah dan ketidaksesuaian dalam tetapan klinikal [3, 22]. Satu kajian baru-baru ini menunjukkan bahawa atezolizumab plus bevacizumab menghasilkan hasil klinikal yang lebih baik daripada sorafenib pada pesakit dengan HCC yang tidak boleh direseksi, menjadikan kombinasi ini kemungkinan pilihan rawatan barisan pertama baru untuk HCC lanjutan [7]. Dalam konteks ini, kami telah mengenal pasti bahawa glikosida phenylethanoid,Acteoside daripada cistanchemenghalang percambahan sel, pembentukan koloni dan penghijrahan dalam tiga garisan sel HCC manusia BEL7404, HLF dan JHH-7 serta angiogenesis yang dilarang bagi HUVEC. Gabungan acteoside dan sorafenib menghasilkan perencatan yang lebih kuat terhadap pembentukan koloni sel dan penghijrahan sel HCC serta angiogenesis HUVEC. Acteoside mempersembahkan keberkesanan antitumor dalam model tikus bogel xenograf BEL7404 atau JHH-7, dengan peningkatan apabila digabungkan dengan sorafenib dalam menghalang pertumbuhan JHH-7 xenograf. Analisis lanjut mendedahkan peningkatan dalam p53 serta penurunan beberapa gen KLK. Sehubungan itu, kemungkinan penggunaan acteoside sebagai tambahan dalam rawatan HCC lanjutan di klinik perlu dipertimbangkan.

Bukti pemasangan telah menunjukkan kesan antitumor daripadaActeoside daripada cistanchedalam pelbagai sel tumor seperti sel melanoma B16, sel glioblastoma, sel kanser kolorektal, sel karsinoma sel skuamosa mulut, sel kanser prostat, dan sel adenokarsinoma payudara manusia [11-13, 23-25] atau dalam haiwan yang mempunyai tumor [12]. Walaupun begitu, beberapa kajian telah memberi tumpuan kepada kesan acteoside pada HCC in vitro atau in vivo kecuali satu kajian menggunakan diethylnitrosamine sebagai karsinogen untuk mendorong hepatokarsinogenesis pada tikus dan mendedahkan kemoprevensi oleh acteoside [26]. Dalam kajian semasa, kami menunjukkan perencatan oleh acteoside percambahan sel, pembentukan koloni, dan penghijrahan dalam garisan sel HCC serta pertumbuhan tumor pada tikus yang mengandungi xenograf sel sel HCC, dengan itu secara langsung menunjukkan kesan antitumor acteoside dalam HCC. Tambahan pula, gabungan acteoside dan sorafenib menghasilkan kesan antitumor yang lebih kuat. Digabungkan dengan bukti bahawa acteoside adalah pelindung terhadap kecederaan hati [27-29] tanpa kesan toksik pada haiwan dan tiada kemutagenan [30], nampaknya boleh dilaksanakan untuk aplikasi masa depan terapi kombinasi acteoside dan sorafenib pada pesakit dengan tahap lanjut. HCC di klinik.

Keluarga kallikrein manusia terdiri daripada 15 homolog, rantai tunggal, protease serin seperti trypsin atau chymotrypsin (KLK1-15) yang dirembeskan dan telah terlibat dalam pengawalan pertumbuhan tumor, perkembangan neoplastik, angiogenesis, dan metastasis [18, 31]. Khususnya, KLK telah dicadangkan sebagai biomarker kanser dalam diagnosis dan prognosis pelbagai jenis kanser, termasuk karsinoma hepatoselular disebabkan oleh ekspresi disregulasi [17-19]. Sebagai contoh, KLK1 dicadangkan sebagai biomarker kanser gastrik disebabkan oleh peningkatan tahap KLK1 dalam neoplasma gastrik dan pencegahan pertumbuhan tumor dalam kanser gastrik dengan menghalang aktiviti KLK1 dengan protein pengikat kallikrein (KBP) [32]. Dalam senario ini, kami melihat perencatan ketara tahap mRNA KLK oleh acteoside (KLK1, 2, 4, 9, dan 10). Penggunaan KBP, yang secara khusus mengikat kallikrein tisu dan menghalang aktiviti kallikrein, dilaporkan untuk menyekat pertumbuhan HCC pada tikus mungkin melalui aktiviti anti-angiogeniknya [33], mencadangkan kemungkinan penglibatan KLK dalam perkembangan HCC. Di samping itu, protein penindas tumor p53 mampu mendorong penuaan, apoptosis serta penangkapan kitaran sel. Peningkatan ekspresi p53 memberikan kemosensitiviti yang dipertingkatkan dalam sel-sel kanser [34]. Dalam hal ini, keputusan barat kami menunjukkan peningkatan dalam tahap p53 berikutan rawatan dengan acteoside. Secara keseluruhannya, adalah munasabah untuk membuat kesimpulan bahawa acteoside memberi kesan antitumor pada HCC mungkin melalui pengawalseliaan p53 serta perencatan KLK dan angiogenesis.

Perlu diingatkan bahawa sasaran molekul langsung yangActeoside daripada cistancheboleh mengikat secara langsung masih tidak jelas. Data awal kami menggunakan dok molekul mendedahkan pengikatan langsung acteoside dengan kallikrein (data tidak ditunjukkan). Eksperimen lanjut diperlukan untuk menjelaskan anggapan ini. Selain itu, bagi dos acteoside yang digunakan untuk ujian sel dalam kajian 10–50 kali lebih tinggi daripada sorafenib (10 μM), pertama sekali kami memilih dos acteoside tersebut mengikut hubungan dos-tindak balas dalam ujian MTT. Kedua, dos yang kami gunakan (100, 500 μM) adalah setanding dengan kajian terdahulu [35], di mana acteoside (100 μM) menghalang percambahan sel sel kanser kolorektal. Terakhir, walaupun dos yang lebih tinggi dalam ujian sel, acteoside menghasilkan perencatan pertumbuhan tumor yang ketara dalam model tikus bogel xenograf HCC dalam kajian kami (25 dan 50 mg / kg), kesannya serupa dengan sorafenib (50 mg / kg). Untuk sorafenib, ia digunakan dalam kajian kami pada dos 10 μM pada tahap selular. Dos ini adalah setanding dengan kajian terdahulu di mana sorafenib didapati menghalang daya maju sel dengan IC50 sebanyak 4.0-6.5 μM dalam garisan sel HCC sel PLC/PRF/5 dan HepG2. Sebaliknya, dos sorafenib yang digunakan untuk menyekat pertumbuhan xenograf HCC dalam tikus betina SCID ialah 30 mg/kg (po by gavage) [36]. Di klinik, dos sorafenib yang disyorkan untuk pesakit ialah 400 mg setiap kali (2*0.2 g), dua kali sehari (jumlah 800 mg sehari). Dos untuk sorafenib yang digunakan di klinik ini adalah berbeza dengan dos yang digunakan dalam ujian sel (nilai IC50 dalam tahap μM), mungkin disebabkan oleh kebolehserapannya yang lemah dalam keadaan in vivo. Untuk acteoside, berdasarkan dosnya dalam tikus (50 mg/kg, ig), dos yang setara untuk manusia (60 kg BW) ialah kira-kira 250 mg. Dos ini adalah setanding dengan sorafenib yang digunakan di klinik dan harus diterima oleh pesakit.

Kesimpulan Kesimpulannya,Acteoside daripada cistanchemampu memberikan kesan antitumor dalam talian sel HCC dan pada tikus bogel yang mengandungi xenograf sel sel HCC, kesan mungkin melalui peningkatan tahap p53 serta melarang KLK dan angiogenesis. Acteoside boleh berguna sebagai tambahan dalam rawatan HCC lanjutan di klinik.

Rujukan

1 Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, Siegel RL, Torre LA, Jemal A. Statistik kanser global 2018: Anggaran kejadian dan kematian GLOBOCAN di seluruh dunia untuk 36 kanser di 185 negara. CA Kanser J Clin. 2018;68(6):394–424..

2. Llovet JM, Zucman-Rossi J, Pikarsky E, Sangro B, Schwartz M, Sherman M, Gores G. Karsinoma hepatoselular. Nat Rev Dis Primers. 2016;2:16018.

3. Sim HW, Knox J. Karsinoma hepatoselular dalam era imunoterapi. Curr Probl Cancer. 2018;42(1):40–8. 4. Jiang Y, Han QJ, Zhang J. Karsinoma hepatoselular: mekanisme perkembangan dan imunoterapi. Dunia J Gastroenterol. 2019;25(25):3151– 67.

5. Forner A, Da Fonseca LG, Diaz-Gonzalez A, Sanduzzi-Zamparelli M, Reig M, Bruix J. Kontroversi dalam pengurusan karsinoma hepatoselular. JHEP Rep. 2019;1(1):17–29.

6. Hartke J, Johnson M, Ghabril M. Diagnosis dan rawatan karsinoma hepatoselular. Semin Diagn Pathol. 2017;34(2):153–9.

7. Finn RS, Qin S, Ikeda M, Galle PR, Ducreux M, Kim TY, Kudo M, Breder V, Merle P, Kaseb AO, et al. Atezolizumab ditambah Bevacizumab dalam Karsinoma Hepatoselular yang Tidak Boleh Diresek. N Engl J Med. 2020;382(20):1894–905.

8. Dia ZD, Ueda S, Akaji M, Fujita T, Inoue K, Yang CR. Glikosida monoterpenoid dan phenylethanoid daripada pedunkular Ligustrum. Fitokimia. 1994;36(3):709–16.

9. Li H, Chou GX, Wang ZT, Hu ZB. Penentuan HPLC bagiacteosidedalam Radix Rehmanniae. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2006;31(10):822–4.

10. Wong IY, He ZD, Huang Y, Chen ZY. Aktiviti antioksidan glikosida phenylethanoid daripada Ligustrum purpurascens. J Agric Food Chem. 2001;49(6):3113–9.

11. Mulani SK, Guh JH, Mong KK. Strategi sintetik umum dan sifat anti-proliferasi pada saluran sel kanser prostat untuk glikosida fenilethanoid semulajadi. Org Biomol Chem. 2014;12(18):2926–37.

12. Cheimonidi C, Samara P, Polychronopoulos P, Tsakiri EN, Nikou T, Myrianthopoulos V, Sakellaropoulos T, Zoumpourlis V, Mikros E, Papassideri I, et al. Sitotoksisiti terpilih bahan herba acteoside terhadap sel tumor dan pandangan mekanistiknya. Biol Redoks. 2018;16:169–78.

13. Attia YM, El-Kersh DM, Wagdy HA, Elmazar MM. Verbascoside: pengenalpastian, kuantifikasi dan potensi pemekaan sel Kanser kolorektal kepada 5-FU dengan menyasarkan laluan PI3K/AKT. Sci Rep. 2018;8(1):16939.

14. Liu S, Zhao Z, Huo Z, Xu Z, Zhong Y, Wang X, Yang Y, Wang Z. Ekstrak akueus bunga Osmanthus fragrans dan acteoside yang diperkaya menghalang melanogenesis dan pigmentasi yang disebabkan oleh ultraviolet. Nat Prod Commun. 2018;13(5):575–80.

15. Wang J, Ma S, Chen X, Zhang S, Wang Z, Mei Q. Novel PI3K inhibitor S1 bersinergi dengan sorafenib dalam sel kanser paru-paru bukan sel kecil yang melibatkan isyarat Akt-S6. Siasat Dadah Baru. 2019;37(5):828–36.

16. Hanahan D, Weinberg RA. Ciri-ciri kanser: generasi akan datang. sel. 2011;144(5):646–74. 17. Emami N, Diamandis EP. Utiliti peptidases berkaitan kallikrein (KLK) sebagai biomarker kanser. Clin Chem. 2008;54(10):1600–7.

18. Tailor PD, Kodeboyina SK, Bai S, Patel N, Sharma S, Ratnani A, Copland JA, She JX, Sharma A. Potensi biomarker diagnostik dan prognostik gen keluarga kallikrein dalam pelbagai jenis kanser. Oncotarget. 2018;9(25): 17876–88.

19. Kontos CK, Mavridis K, Talieri M, Scorilas A. Peptidases berkaitan Kallikrein (KLK) dalam kanser gastrousus: aspek mekanistik dan klinikal. Thromb Haemost. 2013;110(3):450–7.

20. Cheng AL, Kang YK, Chen Z, Tsao CJ, Qin S, Kim JS, Luo R, Feng J, Ye S, Yang TS, et al. Keberkesanan dan keselamatan sorafenib pada pesakit di rantau Asia Pasifik dengan karsinoma hepatoselular lanjutan: percubaan terkawal plasebo fasa III rawak, dua buta, dan terkawal. Lancet Oncol. 2009;10(1):25–34. 21. Llovet JM, Ricci S, Mazzaferro V, Hilgard P, Gane E, Blanc JF, de Oliveira AC, Santoro A, Raoul JL, Forner A, et al. Sorafenib dalam karsinoma hepatoselular lanjutan. N Engl J Med. 2008;359(4):378–90.

22. Lagu MJ. Kemoterapi infusi arteri hepatik untuk karsinoma hepatoselular lanjutan. Dunia J Gastroenterol. 2015;21(13):3843–9.

23. Liao YF, Rao YK, Tzeng YM. Ekstrak akueus Anisomeles India dan sebatian tulennya memberikan aktiviti anti-metastatik melalui perencatan pengaktifan NF kappaB/AP-1-MMP-9 yang bergantung kepada{3}} dalam sel MCF-7 kanser payudara manusia. Toksik Kimia Makanan. 2012;50(8):2930–6.

24. Zhang Y, Yuan Y, Wu H, Xie Z, Wu Y, Lagu X, Wang J, Shu W, Xu J, Liu B, et al. Kesan verbascoside pada apoptosis dan metastasis dalam karsinoma sel skuamosa mulut manusia. Kanser Int J. 2018;143(4):980–91.

25. Hwang TW, Kim DH, Kim DB, Jang TW, Kim GH, Moon M, Yoon KA, Choi DE, Park JH, Kim JJ. Kesan antikanser sinergistik kemoterapi glioblastoma berasaskan acteoside dan temozolomide. Int J Mol Med. 2019; 43(3):1478–86.

26. Peerzada KJ, Faridi AH, Sharma L, Bhardwaj SC, Satti NK, Shashi B, Tasduq SA. Acteoside-mengantara kemopencegahan karsinogenesis hati percubaan melalui tekanan oksidatif dan apoptosis terkawal STAT-3. Toksik Persekitaran. 2016;31(7):782–98.

27. Cui Q, Pan Y, Zhang W, Zhang Y, Ren S, Wang D, Wang Z, Liu X, Xiao W. Metabolit Acteoside pemakanan: profil, pengasingan, pengenalan, dan kapasiti Hepatoprotective. J Agric Food Chem. 2018;66(11):2660–8.

28. Xiong Q, Hase K, Tezuka Y, Namba T, Kadota S. Acteoside menghalang apoptosis dalam D-galactosamine dan kecederaan hati yang disebabkan oleh lipopolysaccharide. Life Sci. 1999;65(4):421–30.

29. Zhao J, Liu T, Ma L, Yan M, Zhao Y, Gu Z, Huang Y. Kesan perlindungan acteoside pada kecederaan hati imunologi yang disebabkan oleh Bacillus Calmette Guerin ditambah lipopolysaccharide. Planta Med. 2009;75(14):1463–9.

30. Lu B, Li M, Zhou F, Huang W, Jiang Y, Mao S, Zhao Y, Lou T. Ekstrak kaya phenylethanoid glycoside bunga wangi Osmanthus: kajian ketoksikan akut dan subkronik. J Ethnopharmacol. 2016;187:205–12.

31. Diamandis EP, Yousef GM. Kallikreins tisu manusia: keluarga biomarker kanser baru. Clin Chem. 2002;48(8):1198–205.

32. Sawant S, Snyman C, Bhoola K. Perbandingan kallikrein tisu dan ekspresi reseptor kinin dalam ulser gastrik dan neoplasma. Int Immunopharmacol. 2001;1(12):2063–80.

33. Lu L, Yang Z, Zhu B, Fang S, Yang X, Cai W, Li C, Ma JX, Gao G. Kallikreinbinding protein menyekat pertumbuhan karsinoma hepatoselular oleh aktiviti antiangiogenik. Kanser Lett. 2007;257(1):97–106.

34. Guntur VP, Waldrep JC, Guo JJ, Selting K, Dhand R. Meningkatkan protein p53 mensensitisasikan kanser paru-paru bukan sel kecil kepada paclitaxel dan cisplatin secara in vitro. Antikanser Res. 2010;30(9):3557–64.

35. Zhou L, Feng Y, Jin Y, Liu X, Sui H, Chai N, Chen X, Liu N, Ji Q, Wang Y, Li Q. Verbascoside menggalakkan apoptosis dengan mengawal isyarat HIPK2-p53 pada manusia kanser kolorektal. Kanser BMC. 2014;14:747.

36. Liu L, Cao Y, Chen C, Zhang X, McNabola A, Wilkie D, Wilhelm S, Lynch M, Carter C. Sorafenib menyekat laluan RAF/MEK/ERK, menghalang angiogenesis tumor, dan mendorong apoptosis sel tumor dalam hepatoselular model karsinoma PLC/PRF/5. Kanser Re. 2006;66:11851–8.