Ekstrak Daun Abrus Precatorius Membalikkan Diabetes Melitus Terinduksi Alloxan/Nicotinamide dalam Tikus Melalui Modulasi Hormon (Insulin, GLP-1, Dan Glukagon) Dan Enzimatik ( -Amilase/ - Glucosidase) Bahagian 1

Sila hubungioscar.xiao@wecistanche.comuntuk maklumat lanjut

Latar belakang

Abrus precatorius digunakan dalam perubatan rakyat di seluruh wilayah Afro-Asia di dunia. Terdahulu, kesan penurun glukosa dan perlindungan pankreas bagi ekstrak daun Abrus precatorius (APLE) telah disahkan secara eksperimen dalam tikus diabetes yang disebabkan oleh STZ/nikotinamide; walau bagaimanapun, mekanisme asas kesan antidiabetik dan perlindungan pankreas kekal tidak diketahui. Objektif. Kajian ini menjelaskan mekanisme antidiabetik dan kesan perlindungan pankreas APLE dalam tikus diabetes. Bahan dan Kaedah. APLE disediakan dengan kaedah pengekstrakan etanol/Soxhlet. Jumlah fenol dan flavonoid dikira secara kalorimetrik selepas pemeriksaan fitokimia awal. Diabetes mellitus (DM) telah ditubuhkan pada tikus dewasa Sprague-Dawley (berberat 120-180 g) kedua-dua jantina dengan suntikan berurutan harian nikotinamide (48 mg/kg; ip) danAlloxan(120mg/kg; ip) dalam tempoh 7 hari. Kecuali tikus kawalan yang mempunyai glukosa darah puasa (FBG) 4.60 mmol/L, tikus yang mempunyai FBG (16-21 mmol/L) yang stabil 7 hariselepas nikotinamida/Alloxansuntikan dianggap diabetes dan secara rawak ditugaskan semula kepada salah satu kumpulan berikut (model, APLE(100, 200, dan 400 mg/kg, masing-masing; PO) dan metformin (300 mg/kg; PO)) dan dirawat setiap hari selama 18 hari . Berat badan dan FBG diukur setiap 72 jam selama 18 hari. Pada hari ke-18, tikus telah berkorban di bawah dalambius; organ (buah pinggang, hati, pankreas, dan limpa) diasingkan dan ditimbang. Darah dikumpul untuk menganggar insulin serum, glukagon dan (LP-1 menggunakan kit ELSA khusus tikus,' Pankreas telah diproses. dibelah dan diwarnakan H&E untuk pemeriksaan histologi. Kesan APLE padaenzimatikaktiviti alpha (a)-amilase dan -glucosidase telah dinilai. Antioksidan dan sifat penghapusan radikal bebas APLE dinilai menggunakan kaedah standard. Keputusan. Bergantung kepada dos APLE menurunkan FBG awal sebanyak 68.67 peratus, 31.07 peratus, dan 4.39 peratus berbanding model (4.34 peratus) dan metformin (43.63 peratus). Rawatan APLE(100 mg/kg) memulihkan penurunan berat badan berbanding model. APLE meningkatkan insulin serum dan GLP{14}} tetapi mengurangkan glukagon serum berbanding model. APLE meningkatkan kedua-dua bilangan dan luas keratan rentas median (×10 darjah um') pulau kecil pankreas berbanding model. APLE menghasilkan perencatan bergantung kepekatan -amilase dan -glukosidase berbanding acarbose. Bergantung pada kepekatan APLE menghilangkan radikal DPPH dan nitrik oksida (NO) dan menunjukkan peningkatan kapasiti antioksidan pengurang ferik (FRAC) berbanding piawaian. Kesimpulan. Kesan antidiabetik APLE dimediasi melalui modulasi insulin dan GLP-1 secara songsang dengan glukagon, perencatan tidak kompetitif c-amilase dan -glucosidase, penghapusan radikal bebas dan pemulihan sel-sel pankreas yang rosak/nekro-apoptosis.

Sila klik di sini untuk mengetahui lebih lanjut

1. Pengenalan

Diabetes mellitus (DM) adalah salah satu sindrom metabolik yang dicirikan oleh hiperglikemia kronik yang berpunca daripada metabolisme glukosa yang tidak terkawal akibat kecacatan dalam fungsi sel pankreas [1]. Secara patologi, DM adalah hasil daripada kesilapan dalam metabolisme glukosa akibat kecacatan dalam fungsi sel pankreas yang menyebabkan sama ada kekurangan insulin (DM jenis 1) atau rintangan insulin (DM jenis 2). Gejala biasa DM termasuk polifagia, polidipsia, penglihatan kabur, kehilangan kronik dalam berat badan, gastroparesis, dan poliuria [2]. Dari masa ke masa, hiperglikemia yang tidak dapat diselesaikan meningkatkan risiko komplikasi mikrovaskular DM seperti nefropati diabetik, retinopati diabetik, dan neuropati diabetik [2]. Komplikasi ini berlaku disebabkan oleh tekanan oksidatif dan lipid yang meluasperoksidasiyang merupakan hasil sampingan tindak balas antara glukosa dan molekul biologi [3]. Glikosilasi molekul biologi yang meluas seperti DNA, protein dan lipid membawa kepada penjanaan perantaraan biokimia yang tidak stabil yang berfungsi sebagai sumber spesies oksigen reaktif (ROS) dan spesies nitrogen (RNS). ROS dan RNS adalah pemacu utama tindak balas pengoksidaan dan peroksidatif. dalam pelbagai sel dan tisu [3].

Dari segi epidemiologi, dilaporkan bahawa DM menjejaskan lebih 387 juta orang di seluruh dunia [4]. Anggaran sementara ini diunjurkan meningkat kepada 592 juta menjelang tahun 2035 [5]. Pada mulanya, DM dianggap sebagai permulaan dewasa, tetapi kini, DM ditunjukkan sebagai bebas daripada umur, yang jelas menunjukkan betapa besarnya ancaman yang ditimbulkan. oleh DM kepada kesihatan global.

Cistanche boleh meningkatkan imuniti

Secara konvensional, rawatan DM (jenis 1 dan 2) melibatkan penggunaan agen antidiabetik, yang dikelompokkan sebagai bukan insulin (termasuk biguanida (cth, metformin), sulfonilurea(cth, glyburide), SGLT-2 perencat(cth, dapagliflozin), penyerap asid hempedu (cth, colesevelam), amylin mimetic(cth, pramlintide),dopamine-2 agonis (cth, bromocriptine), DPP-4 inhibitors (cth, sitagliptin), GLP{{5 }}RA (cth, exenatide), thiazolidinedione (cth, rosiglitazone), dan -glucosidase inhibitors (cth, Acarbose dan voglibose)) dan terapi insulin (cth, insulin manusia dan analog) [6]. Terapi antidiabetik konvensional telah terbukti berkesan walaupun pada hakikatnya penggunaan sesetengah daripadanya adalah kostif dan mungkin dikaitkan dengan kesan sampingan yang serius[7]. Kos, kesan sampingan dan kepercayaan umum bahawa ubat konvensional adalah sintetik dan dalam hal ini tidak selamat berbanding dengan ubat herba, yang dianggap "semula jadi" dan agak selamat telah menyumbang kepada minat baharu dalam penggunaan herba dan herba. produk untuk rawatan dan pengurusan penyakit manusia termasuk DM [8,9]. Paradigma ini agak biasa di negara tropika yang lebih miskin di dunia, di mana kebanyakan orang bergantung pada ubat herba untuk memenuhi keperluan penjagaan kesihatan utama mereka [8]. Juga, ini mungkin mengesahkan dakwaan biasa bahawa penggunaan herba mendahului perubatan moden dan bahawa produk semula jadi terus berfungsi sebagai templat untuk sintesis farmaseutikal ubat baharu[10]termasuk agen antidiabetik. Yang penting, herba dan terapi yang berasal dari herba ini digunakan sebagai terapi tambahan dengan cara yang mencerminkan sistem kepercayaan dan warisan etnobotani kebanyakan komuniti tempatan di seluruh wilayah Afro-Asia di dunia. Sebagai contoh, banyak tumbuhan ubatan dengan tuntutan etnobotani untuk rawatan diabetes mellitus seperti Chrysobalanus orbicularis[11], Spondias mombin dan Mangifera indica[12], Sesamum indicum [13], dan Bryophyllum pinnatum [14] semuanya telah menunjukkan -amilase dan -kesan perencatan glukosidase yang dianggap penting untuk kawalan glisemik. Sebagai tindak balas kepada minat baharu dalam penggunaan herba dan produk terbitan herba sebagai terapi tambahan atau alternatif, Pertubuhan Kesihatan Sedunia (WHO) bersama-sama kumpulan berkepentingan lain telah mengesyorkan penggabungan sistem penyembuhan asli, khususnya ubat herba ke dalam sistem penjagaan kesihatan negara-negara miskin [15]. Pengesyoran ini memerlukan keperluan untuk mengesahkan tuntutan kesihatan ke atas herba perubatan yang biasa digunakan oleh penduduk tempatan untuk merawat penyakit manusia[16,17]. Menariknya, Abrus pre-catorius yang biasa dipanggil "kacang jequirity" ialah herba ubatan yang digunakan secara meluas dalam perubatan rakyat banyak budaya di seluruh wilayah Afro-Asia di dunia untuk rawatan penyakit manusia[18-20]. Beberapa laporan telah menyerlahkan kegunaan tradisional daun Abrus precatorius dalam rawatan dan pengurusan diabetes mellitus[21-23]. Daripada nota, ekstrak daripada daun Abrus precatorius telah menunjukkan keberkesanan terhadap diabetes mellitus [1] dan kanser payudara [24], dua penyakit manusia yang telah menyumbang secara signifikan kepada beban penyakit global [25]. Banyak kajian telah membenarkan penggunaan etnofarmakologi dan tuntutan perubatan lain Abrus precatorius dengan menunjukkan secara eksperimen sifat biologinya termasuk penghapusan radikal bebas [26], perlindungan reno [27], perlindungan neuro [28], imunomodulator [19], anti-radang. [29],anti-lipotoksisiti [30], dan pengagregatan antiplatelet [31]sekadar menyebut tetapi sampel.

Sebelum ini, kesan penurun glukosa dan perlindungan pankreas APLE telah ditunjukkan secara eksperimen dalam tikus diabetes yang disebabkan oleh STZ/nikotinamide untuk mengesahkan penggunaannya sebagai ubat rakyat antidiabetik oleh penduduk tempatan di wilayah barat Ghana [1]. Walau bagaimanapun, mekanisme yang mendasari kesan penurunan glukosa dan perlindungan pankreas APLE kekal kurang jelas. Pada masa ini, mekanisme yang mendasari kesan penurunan glukosa dan perlindungan pankreas APLE seperti modulasi insulin, glukagon dan GLP-1, perencatan aktiviti enzimatik -amilase, dan -glucosidase, penghapusan radikal bebas, dan pemulihan kerosakan sel pankreas dan nekro-apoptosis ditunjukkan secara in vivo dan in vitro.

2. Bahan-bahan dan cara-cara

2.1. Dadah dan Bahan Kimia. Alloxan monohydrate(Sigma-Aldrich Co., St.Louis, MO, USA), nicotinamide(Sigma-Aldrich Co., St.Louis, MO, USA), acarbose (LGM Pharma, USA), metformin (Bristol laboratories Ltd.) , asid gallic (Merck KGaA, USA), rutin(Acros organics, USA), asid askorbik (Carl Roth, Jerman), quercetin(Alfa Aesar, UK), p-nitrophenyl glucopyranoside (pNPG)(BBI Biotech, China), Rat Kit Insulin ELISA, Kit Glucagon-ELISA Tikus dan Kit GLP-1 ELSA Rat (Wuxi Donglin Sci & Tech Development Co.Ltd, China) telah digunakan dalam kajian. Semua pelarut dan bahan kimia lain yang digunakan dalam kajian adalah gred analitik.

2.2. Pengumpulan, Pengenalpastian dan Pengesahan Daun Abrus precatorius. Daun segar A. precatorius dikutip dari tanah ladang yang tidak ditanam di Sefwi Asawinso'A'(Daerah Bibiani-Ahwiaso-Bekwai, Wilayah Barat, Ghana). Daun telah dikenal pasti dan disahkan oleh ahli botani bertauliah di unit herbarium, Sekolah Sains Biologi, Universiti Cape Coast, di mana spesimen baucar (CC3366) telah disimpan seperti yang dilaporkan sebelum ini [1].

2.3.Penyediaan Ekstrak Daun Abrus precatorius(APLE). APLE telah disediakan mengikut kaedah sebelumnya [1]. Secara ringkas, daun A. precatorius yang dikeringkan teduh telah digiling secara mekanikal menjadi serbuk halus. Daun serbuk disimpan dalam bekas plastik kedap udara sebelum digunakan. Kuantiti 120g daun serbuk direndam dalam 700 mL etanol selama 48 jam dan ditutup dengan kain kasa. Campuran dikacau sekurang-kurangnya 3 kali sehari. Pada hari kedua, campuran itu ditapis melalui kertas penapis yang dipasang dalam corong Buchner. Turasan telah tertakluk kepada pemisahan menggunakan penyejat berputar yang dipasang pada mandi air. Selepas mengambil etanol menggunakan penyejat berputar, cecair sirap hijau gelap yang terhasil dikeringkan dalam desikator selama beberapa minggu meninggalkan ekstrak pepejal hijau gelap. Ekstrak telah dilabel dan disimpan dalam desikator sebelum digunakan. APLE disediakan secara berterusan untuk mendapatkan kuantiti yang mencukupi untuk semua eksperimen.

2.4.Penyaringan Fitokimia APLE.APLE telah disaring untuk kehadiran fitokomponen seperti yang dilaporkan sebelum ini [1]. 2.5.Penentuan Jumlah Kandungan Fenolik (TPC) dalam APLE. Jumlah kandungan fenolik dalam APLE ditentukan dengan menggunakan kaedah reagen Folin Ciocalteu seperti yang diterangkan sebelum ini [32] dengan sedikit pengubahsuaian. Kepekatan cair APLE （250μL 1mg/mL）dicampurkan dengan 750μL reagen Folin Ciocalteu（1 dalam 10 pencairan dengan air） dan 750μL 7 peratus Na, CO. Campuran kemudiannya dibuat sehingga 5mL dengan air suling dan diinkubasi suhu bilik selama 2 jam untuk perkembangan warna. Penyerapan kemudiannya diukur pada 765 nm dengan menggunakan spektrofotometer (UV-vis, T70 PG Instrumen). Selepas penyediaan lengkung asid gallik piawai (0-300ug/mL), TPC dalam APLE telah diekstrapolasi daripada lengkung penentukuran asid gallik dan dinyatakan dalam setara asid gallik(GAE). Semua eksperimen dijalankan dalam tiga kali ganda.

2.6.Penentuan Jumlah Kandungan Flavonoid(TFC) dalam APLE. Jumlah kandungan flavonoid dalam APLE diukur mengikut kaedah yang diterangkan sebelum ini [33] dengan beberapa pengubahsuaian. Secara ringkasnya, 500μL ekstrak tumbuhan Abrus precatorius （1 mg/mL）yang disediakan dalam 50 peratus etanol dicampur dengan 500 μL 10 peratus aluminium klorida（AlCl,.6H,O） dan 1500μL 10 peratus natrium asetat (NAC,H,H). ,.3H,O). Campuran tindak balas telah diinkubasi pada suhu bilik selama 40 minit, dan penyerapan diukur pada 415 nm menggunakan spektrofotometer (UV-vis, T70 PG Instrumen). Selepas penyediaan lengkung penentukuran rutin (0-250}ug/mL) standard, TFC dalam APLE telah diekstrapolasi daripada lengkung penentukuran rutin dan dinyatakan dalam kesetaraan rutin (RE). Semua eksperimen dijalankan dalam tiga kali ganda.

2.7. Kelulusan Etika. Semua protokol yang melibatkan haiwan pada mulanya disemak dan diluluskan oleh Lembaga Kajian Institusi Universiti Sains dan Teknologi Kwame Nkrumah (KNUST) mengenai Eksperimen Haiwan (FPPS/PCOL/006/2019). Selain itu, eksperimen yang melibatkan tikus telah dijalankan mengikut Arahan Kesatuan Eropah (2010/63/EU) mengenai penggunaan dan penjagaan haiwan dalam eksperimen saintifik. Penderitaan haiwan dan bilangan haiwan dikurangkan sebanyak mungkin untuk mematuhi keperluan dalam pengesyoran 3R (Pemurnian, Penggantian, dan Pengurangan) [34].

2.8. Pemerolehan dan Penjagaan Haiwan Eksperimen. Tikus Sprague-Dawley dewasa 7-8-yang sihat berumur seminggu dari kedua-dua jantina (berberat antara 120 dan 180g) telah dibeli daripada Institut Penyelidikan Perubatan Noguchi (NMRI), Universiti Ghana. Tikus kemudian diangkut ke Rumah Haiwan Jabatan Sains Bioperubatan, Universiti Cape Coast, Cape Coast, Ghana. Tikus ditempatkan dalam sangkar tahan karat (34sm×47sm×18sm) dengan pencukur kayu kering sebagai tempat tidur, diberi makan tikus biasa (GAFCO, TEMA), dan mempunyai akses tanpa had kepada air. Tikus telah dikekalkan di bawah keadaan persekitaran suhu, kelembapan dan kitaran gelap/cahaya biasa. Walau bagaimanapun, syarat-syarat ini dipelbagaikan untuk memenuhi keperluan khusus beberapa eksperimen. Tikus dibenarkan untuk membiasakan diri di bawah keadaan ambien dan makmal ini selama lebih dua minggu sebelum digunakan dalam eksperimen.

2.9.Penubuhan Alloxan/Nicotinamide-Induced Diabetes Mellitus dalam Tikus. Diabetes mellitus eksperimen telah ditubuhkan pada tikus Sprague-Dawley dewasa normoglikemik yang berpuasa semalaman mengikut kaedah yang diterangkan sebelum ini [1, 35] dengan beberapa pengubahsuaian. Secara ringkas, tikus disuntik secara berurutan dengan nikotinamida (48 mg/kg; IP) yang dilarutkan dalam larutan garam biasa dan dikekalkan di atas ais; kemudian, 15 minit kemudian, Alloxan (120mg/kg; ip) telah disusun semula dalam larutan penimbal sitrat 100 mM (pH4.5) diberikan kepada tikus setiap hari selama 7 hari. Selepas itu, tikus diberi 5 peratus larutan glukosa (5 mL/kg; PO) setiap hari selama 7 hari. Untuk mengesahkan penubuhan hiperglikemia pada tikus, darah dikumpulkan daripada tikus yang berpuasa semalaman 3-7 hari selepas Alloxan/nicotinamide dan 5 peratus rawatan glukosa menggunakan kaedah amputasi hujung ekor. Ekor tikus terlebih dahulu disapu bersih dengan kapas steril yang dicelup dalam 10 peratus etanol. Glukosa darah puasa (FBG) diukur dengan menggunakan glucometer URIT G26(URIT Medical Electronic Co., Ltd.).

2.10.Experimental Design. A curative rather than prophylactic treatment approach was adopted in this study, where after the establishment of experimental diabetes mellitus in rats, diabetic rats were subjected to various treatments. Figure 1 shows an outline of experiments carried out in this study. Rats having consistent FBG(11.1 mmol/L or >250mg/dL)selepas pengukuran berganda dianggap menghidap diabetes mellitus(hiperglisemia)[1,35].Tikus diabetes yang disahkan telah diagihkan secara rawak kepada lima kumpulan. Tikus kawalan tidak terdedah kepada Alloxan; sebaliknya, mereka diberi garam biasa. Semua kumpulan telah dirawat untuk tempoh 18 hari seperti yang ditunjukkan di bawah:

Kawalan: garam biasa(5 mL/tikus/hari;po) ditambah ayam tikus ditambah air

Model: nikotinamida (48mg/kg ip) ditambah Alloxan(120mg/kg;ip) ditambah ayam tikus serta air

Metformin: nikotinamida (48mg/kg; ip) ditambah Alloxan (120 mg/kg; ip) ditambah metformin(300mg/kg; po) ditambah ayam tikus serta air

APLE(100 mg/kg): nikotinamida(48 mg/kg; ip) ditambah Alloxan (120mg/kg; ip) ditambah APLE(100mg/kg; po) ditambah ayam tikus serta air

APLE(200 mg/kg): nikotinamida(48 mg/kg; ip) ditambah Alloxan (120mg/kg; ip) ditambah APLE(200mg/kg; po) ditambah ayam tikus serta air

APLE(400 mg/kg):nicotinamide(48 mg/kg; ip) ditambah Aloxan (120mg/kg; ip) ditambah APLE(400mg/kg po) ditambah ayam tikus serta air

2.11. Pengukuran Berat Badan.Berat badan tikus diukur sebelum permulaan semua eksperimen haiwan. Selepas itu, berat badan tikus dalam semua kumpulan diukur setiap 3 hari selama 18 hari. Dos diselaraskan untuk mencerminkan perubahan berat badan setiap 3 hari. Akhirnya, berat badan tikus dalam semua kumpulan diukur sebelum pengorbanan mereka.

2.12. Pengumpulan Darah, Penyediaan Sera, dan Pengasingan Organ.Selepas menimbang tikus pada hari ke-18, tikus dikorbankan di bawah anestesia kloroform dalam. Sampel darah dikumpulkan melalui tusukan jantung dan kemudian disalurkan ke dalam tiub vacutainer kosong berlabel. Sampel darah wakil bagi setiap kumpulan telah disentrifugasi pada 3000rpm (Eppendorf sentrifuge 5702,4 darjah) selama 5 minit. Untuk mendapatkan sera, supernatan dikumpul ke dalam tiub sampel berlabel masing-masing. Hati, limpa buah pinggang, dan pankreas telah dituai, baru ditimbang, dan difiksasi dalam 10 peratus formalin.

2.13.Pengukuran Insulin Serum, Glukagon dan GLP-1.Paras insulin serum, glukagon dan GLP-1, masing-masing, diukur dengan menggunakan insulin tikus ELISA(Wuxi Donglin Sci &Tech Development Co. Ltd, China), glukagon tikus ELISA (Wuxi Donglin Sci & Tech Development Co.Ltd. , China) dan tikus GLP-1 ELISA(Wuxi Donglin Sci & Tech Development Co.Ltd., China) dengan ketat mengikut arahan pengilang.

2.14.Penentuan Kawasan Median Pulau Pankreas Langerhans.Selepas pemprosesan histologi pankreas perwakilan, fotomikrograf terhasil untuk kumpulan masing-masing telah diimbas dengan menggunakan kamera kanta mata Amscope MD35 seperti yang diterangkan sebelum ini[1]. Setiap fotomikrograf telah dimuat naik ke Adobe photoshop CS6 dan kemudiannya ditindih pada grid stereologi. Bilangan persimpangan yang menutupi stroma pulau pankreas telah dikira. Luas keratan rentas pulau pankreas Langerhans dari pankreas perwakilan ditentukan dengan menggunakan kaedah Cavalieri dan pengiraan titik [36]. Luas keratan rentas ditentukan oleh formula:

di mana

A mewakili kawasan keratan rentas pulau pankreas Langerhans

XP mewakili jumlah bilangan persimpangan yang menutupi stroma pulau pankreas

a/p mewakili kawasan per titik grid stereologi M mewakili pembesaran linear.

2.15. Pengekstrakan -Amilase dari Pankreas Babi Guinea.Selepas 20 jam kelaparan, seekor guinea pig dikorbankan di bawah bius dalam dan pankreas dikeluarkan melalui pembedahan. Pankreas dipotong bebas daripada lemak dan sebarang tisu lain dan segera dibasuh dalam penimbal natrium fosfat (pH7.4). Selepas menimbang pankreas, ia disimpan di dalam peti sejuk pada suhu 4 darjah . Pankreas beku kemudiannya dihomogenkan (1g pankreas: penimbal 5 mL) dengan penimbal natrium fosfat ais sejuk, 0.1 M (pH 7.4) dengan menggunakan penghomogen(WiseTis HG-15D homogenizer) dan kemudian disentrifugasi pada 4400rpm selama 30 minit pada 4 darjah . Supernatan telah dipipet ke dalam tiub mikrofuge yang berasingan dan disimpan dalam peti sejuk pada-20 darjah . Untuk mengesahkan enzim yang diekstrak(-amilase), sebuah -amilase yang tersedia secara komersial telah ditanda aras dengan enzim yang diekstrak(-amilase) menggunakan kanji dan iodin. Pengsan atau hilangnya warna biru-hitam yang dianggap sebagai petunjuk aktiviti -amilase dibandingkan dengan persediaan kawalan (tiada enzim ditambah kanji ditambah iodin) di mana terdapat pewarnaan biru-hitam dalam.

2.16.Kesan APLE terhadap Aktiviti Enzimatik -Amilase.Perencatan aktiviti enzimatik alfa ( )-amilase telah diuji mengikut kaedah sebelumnya [37] dengan beberapa pengubahsuaian. Secara ringkasnya, APLE(125uL) atau acarbose pada kepekatan meningkat (100-1500 ug/mL) telah ditambah pada set tabung uji berlabel yang mengandungi 125 uL larutan -amilase dalam penimbal natrium fosfat 20mM (pH6.9). Campuran APLE atau acarbose/ -amilase telah dipraeram pada suhu 25 darjah selama 10 minit. Selepas itu, 125 uL 1 peratus kanji (disediakan dalam penimbal fosfat 20mM, pH=6.9) telah ditambah pada selang masa yang dipilih. Campuran tindak balas dalam setiap kes diinkubasi pada 25 darjah selama 10 minit. Penamatan setiap tindak balas dilakukan pada selang masa dengan menambah 250uL 3,5-reagen asid dinitrosalicylic(DNSA) dan dipanaskan lagi dalam tab mandi air pada suhu 100 darjah C selama 5 minit, kemudian dibiarkan sejuk ke suhu bilik. Setiap tindak balas dibuat sehingga 2.5mL dengan air suling dan penyerapan diukur pada 540 nm menggunakan spektrofotometer (UV-vis, T70 PG Instrumen). Satu set-up kawalan telah disediakan menggunakan prosedur yang sama kecuali -amilase telah dipraeramkan dengan air suling dan bukannya APLE. Aktiviti perencatan Alpha()-Amilase dikira seperti berikut:

2.17. Cara Perencatan Aktiviti Enzimatik -Amilase oleh APLE.Mod perencatan aktiviti enzimatik -amilase oleh APLE telah dilakukan mengikut kaedah sebelumnya [38] dengan beberapa pengubahsuaian. Secara ringkasnya, 125 μL APLE（5mg/mL） mula-mula diprainkubasi dengan 125 uL larutan -amilase dalam 20mM fosfat pada 25 darjah selama 10 minit dalam satu set tabung uji berlabel. Selepas itu, 125uL larutan kanji pada kepekatan yang berbeza-beza(0.3-5 mg/mL) telah ditambah kepada campuran tindak balas kepada

mulakan reaksi. Campuran tindak balas kemudiannya diinkubasi pada 25 darjah selama 10 minit sebelum penambahan 250uL 3,5-reagen asid dinitrosalicylic (DNSA) untuk menghentikan tindak balas. Jumlah produk yang terbentuk telah diuji dengan mengukur penyerapan pada panjang gelombang 540nm menggunakan spektrofotometer(UV-vis, T70 PG Instrumen). Prosedur ini diulang untuk kawalan yang ditetapkan dengan prainkubasi -amilase dengan penimbal dan bukannya APLE. Plot Lineweaver-Burk daripada plot Michaeles-Menten telah dilakukan menggunakan prisma Graph-Pad versi 8(Perisian Pad Graf, San Diego, CA, Amerika Syarikat) untuk anggaran Km dan Vmax. Mod perencatan aktiviti enzimatik -amilase oleh APLE disimpulkan daripada anggaran Km dan Vmax.

2.18. Pengekstrakan -Glucosidase daripada Usus Kecil Guinea Pig.Pengekstrakan -glukosidase daripada usus babi guinea dilakukan mengikut kaedah sebelumnya [39] dengan beberapa pengubahsuaian. Secara ringkas, babi guinea mula-mula kelaparan selama 20 jam dan kemudian dikorbankan di bawah bius dalam. Usus kecil yang terletak betul-betul di atas sekum dan betul-betul di bawah duodenum dikeluarkan melalui pembedahan dan dibilas dengan teliti dalam penimbal natrium fosfat 0.02 M ais sejuk (pH6.9) sebelum dicelup dalam larutan penimbal segar. Pada perkadaran 1g usus-ne:5 mL penimbal, usus terpencil dihomogenkan (WiseTis HG-15D homogenizer, Jerman) pada 4400rpm selama 10 minit pada 2 minit terhenti seketika pada ais. Homogenat telah disentrifugasi (Eppendorf 5430R sentrifuge) selama 30 minit pada 4 darjah dan supernatan dituai perlahan-lahan. Aliquot dimasukkan ke dalam tiub krio 2mL dan disimpan pada-20 darjah untuk kegunaan segera dalam eksperimen. Untuk mengesahkan enzim yang diekstrak (-glucosidase), -glucosidase yang tersedia secara komersial telah ditanda aras dengan enzim yang diekstrak (a-glucosidase） dengan mengeram 50μL 3mM p-nitrophenyl glucopyranoside（pNPG） dengan 25 μL -25 μL yang boleh didapati secara komersial. μL enzim yang diekstrak （a -glucosidase) pada 25 darjah . Pemerhatian produk p-nitrophenol kuning selepas 5minit dalam setiap kes dianggap sebagai pengesahan aktiviti -glucosidase.

2.19.Kesan APLE terhadap Aktiviti Enzimatik -Glucosidase.Kesan perencatan APLE dan acarbose(perencat -glucosidase standard) telah dinilai mengikut kaedah sebelumnya [40]dengan beberapa pengubahsuaian. Secara ringkasnya, penimbal fosfat (20mM;pH=6.9) telah digunakan untuk menyediakan p-nitrophenyl glucopyranose (pNPG)(substrat untuk -glucosidase). Dalam eksperimen berasingan, a-glucosidase（50 μL） telah diprainkubasi dengan peningkatan kepekatan APLE（25μL dalam setiap kes）, acarbose atau penimbal selama 10 minit dalam setiap kes. Selepas itu, 25uL 3mM p-nitrophenyl glucopyranoside telah ditambah kepada sama ada APLE/a -glucosidase atau acarbose/a-glucosidase campuran prainkubasi untuk memulakan tindak balas. Campuran tindak balas dalam setiap kes diinkubasi pada 25 darjah darjah selama 20 minit. Selepas 20 minit pengeraman, tindak balas dihentikan dengan menambah 0.1 M Na,CO,(1 mL). Kawalan telah disediakan menggunakan prosedur yang sama kecuali -glucosidase telah diprainkubasi dengan penimbal dan bukannya APLE atau acarbose. Hasil tindak balas (p-nitrophenol berwarna kuning) selepas penamatan tindak balas diukur dengan menggunakan spektrofotometer (UV-vis, T70 PG Instrumen) pada 405 nm untuk penentuan aktiviti a-glukosidase. Keputusan dinyatakan sebagai peratusan kawalan. Dalam setiap kes, eksperimen diulang tiga kali. Peratusan ( peratus ) perencatan aktiviti -glukosidase dianggarkan menggunakan formula:

2.20. Mod Perencatan -Glucosidase oleh APLE.Mod perencatan aktiviti enzimatik -glucosidase oleh APLE telah dijalankan mengikut prosedur sebelumnya [41] dengan beberapa pengubahsuaian. Secara ringkas, dalam satu set tabung uji, tepat 25 μL 5 mg/mL APLE telah diprainkubasi dengan larutan -glucosidase（50 μL） pada 25 darjah selama 10 minit. Dalam set tiub kedua, a -glukosidase telah dipraeramkan dengan 50 μL penimbal fosfat 20mM (pH41.9). Kemudian, 25uL p-nitrophenyl glucopyranoside(PNP) pada kepekatan yang berbeza-beza(0.3-3.0 mg/mL) telah ditambah kepada kedua-dua set tabung uji untuk memulakan tindak balas. Campuran tindak balas kemudiannya diinkubasi pada 25 darjah selama 20 minit selepas itu Na, CO, （1000μL） ditambah untuk menamatkan tindak balas. Jumlah produk yang dikeluarkan diukur secara spektrofotometri menggunakan lengkung piawai p-nitrophenol dan ditukar kepada halaju tindak balas, (v). Plot timbal balik berganda (1/v melawan 1/S) di mana S ialah kepekatan substrat telah diplot. Mod perencatan aktiviti -glucosidase oleh APLE ditentukan oleh analisis plot Line weaver-Burk.

2.21. Penilaian 2,2-Diphenyl-1-Picrylhydrazy(DPPH)Aktiviti Penghapusan Radikal.Aktiviti scavenging radikal DPPH telah dijalankan mengikut kaedah sebelumnya [42] dengan beberapa pengubahsuaian. Secara ringkas, campuran tindak balas 2mL telah disediakan dengan mencampurkan DPPH(1.0 mL 0.135mM) yang disediakan dalam metanol dan 1.0mL pelbagai kepekatan APLE (40,80,120,160 , dan 200 ug/mL) atau asid askorbik. Campuran tindak balas digoncang dengan kuat dan dibiarkan dalam gelap pada suhu bilik selama 30 minit. Penyerapan diukur (UV-vis, T70 PG Instrumen) pada 517nm terhadap kosong. Semua ujian dilakukan dalam tiga kali ganda. Jumlah metanol dan larutan DPPH yang sama digunakan sebagai kawalan. Aktiviti penghapusan radikal DPPH dianggarkan dengan menggunakan formula:

2.22.Nitric Oxide (NO) Radical Scavenging Assay.TIADA aktiviti penghapusan radikal APLE dan piawaian dianggarkan menggunakan tindak balas Griess Illosvory seperti yang diterangkan sebelum ini [43] dengan beberapa pengubahsuaian. Secara ringkas, reagen Griess Ilosvory menggunakan 0.1 peratus (w/v) naphthyl ethylene diamine dihydrochloride dan bukannya 5 peratus 1-naphthyl amine. Kepekatan yang berbeza-beza

({{{{1{0}}}}ug/mL)kedua-dua APLE dan piawai (asid galik dan asid askorbik) yang disediakan dan dibuat sehingga 167uL diletakkan dalam tabung uji berlabel, dan kemudian,667 uL daripada 10mM natrium nitroprusside telah ditambah. Penampan natrium fosfat (167uL, pH7.4) kemudiannya ditambah, dan campuran itu diinkubasi pada 25 darjah darjah selama 150 minit. Selepas itu, reagen asid sulfanilik 2000 μL (0.33 peratus dalam 20 peratus asid asetik glasier) telah ditambah dan dibenarkan berdiri selama 5 minit untuk menyelesaikan tindak balas diazotisasi. Akhirnya, 2000μL lagi 0.1 peratus naptil etilena diamina dihidroklorida ditambah, dicampur, dan kemudian dibiarkan selama 30 minit pada suhu 25 darjah . Kepekatan nitrit diukur (UV-vis, T70 PG Instrumen) pada 546nm dan dikira dengan larutan nitrat kawalan yang tidak mempunyai APPLE/atau piawaian tetapi mempunyai semua komponen campuran tindak balas yang lain. Penampan natrium fosfat digunakan sebagai larutan kosong. Peratusan( peratus )TIADA keupayaan penghapusan APLE dan piawaian dikira menggunakan formula:

di mana Ac ialah penyerapan kawalan dan At ialah penyerapan ujian (APLE/standard).

2.23.Ferric Reducing Antioxidant Capacity(FRAC) Assay.FRAC telah diuji mengikut kaedah sebelumnya [44] dengan sedikit pengubahsuaian. Secara ringkas, tindak balas terdiri daripada 250uL APLE/larutan piawai pada kepekatan berbeza(12.5-200ug/mL), 625 uL penimbal natrium fosfat(0.2M pada pH6.6 ), dan 625 uL 1 peratus kalium ferik sianida, [K,Fe(CN)] ke dalam pelbagai tabung uji. Ini telah diinkubasi selama 20 minit pada 50 darjah untuk melengkapkan tindak balas. Kemudian, 625uL larutan asid trichloro asetik (TCA) 10 peratus telah ditambah ke dalam tabung uji. Jumlah campuran telah disentrifugasi pada 3000rpm selama 10 minit, selepas itu 1800 uL supernatan diambil dan dicampur dengan 1800 μL air suling. Selepas itu, 360 μL 0.1 peratus larutan ferik klorida（FeCl,）ditambah dan dicampur dengan teliti. Penyerapan larutan diukur pada 700nm menggunakan spektrofotometer(UV-vis, T70 PG Instrumen) terhadap kosong tindak balas. Larutan kosong biasa yang mengandungi campuran larutan yang sama tanpa APLE/atau kuersetin diinkubasi dalam keadaan yang sama. Peningkatan penyerapan campuran tindak balas menunjukkan peningkatan kapasiti pengurangan. Eksperimen diulang tiga kali pada setiap kepekatan. FRAC diukur sebagai quercetin equivalent (QE).

2.24. Anggaran IC dan EC0 Untuk menentukan IC dan ECsoof APLE masing-masing dengan antioksidannya, penghapusan radikal bebas dan kesan perencatan pada aktiviti enzim -amilase dan -glucosidase, satu siri peningkatan kepekatan APLE telah diuji terhadap masing-masing. aktiviti. Selepas menukar kepekatan kepada logout telah diplot pada paksi mendatar terhadap peratus aktiviti maksimum (antioksidan, penghapusan radikal bebas, dan kesan perencatan pada aktiviti enzim -amilase dan a-glukosidase) pada paksi menegak. Kepekatan APLE yang menghasilkan 50 peratus aktiviti maksimum (antioksidan,

penghapusan radikal bebas, dan kesan perencatan pada aktiviti enzimatik -amilase dan a-glucosidase) yang diuji ditentukan secara grafik menggunakan perisian statistik GraphPad prism versi 8.

2.25. Analisis statistik.Data yang diperolehi dibentangkan sebagai min±SD. Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan Graph Pad Prism Versi 8 untuk Windows (Graph Pad Software, San Diego, CA, USA). Perbandingan min antara kumpulan dilakukan dengan menggunakan analisis varians sehala (ANOVA) diikuti dengan ujian perbandingan berganda Tukey. P Kurang daripada atau sama dengan 0.05 dianggap signifikan secara statistik dalam semua analisis.

Artikel ini diekstrak daripada Hindawi BioMed Research International Volume 2021, ID Artikel 9920826, 17 halaman https://doi.org/10.1155/2021/9920826