Novel Penyediaan Albumin Serum Manusia S-sulfihidrat Menekan Sintesis Melanin

Hubungi:jaslyn.ji@wecistanche.com

Albumin serum manusia (HSA) adalah protein yang paling banyak dalam serum dan digunakan secara meluas sebagai pembawa ubat kerana biokompatibiliti dan sifat pengekalan plasma yang panjang [14,15]. HSA mengandungi sejumlah 35 sisa Cys dan salah satu daripadanya, Cys34, terdapat dalam bentuk kumpulan tiol bebas [16]. Cys34 kadangkala menjadi sasaran untuk tapak pengikat dadah, kerana kumpulan tiol reaktifnya [17,18]. Sebagai contoh, dengan kehadiran nitrik oksida (NO) kumpulan Cys34 tiol adalah S-nitrosated. Kami sebelum ini menunjukkan bahawa S-nitrosated HSA (SNO-HSA) membenarkan NO untuk dikekalkan untuk tempoh yang lama dalam serum [19]. SNO-HSA mempunyai pelbagai fungsi biologi, termasuk kesan perlindungan hati terhadap iskemia/reperfusi [20] dan kesan penindasan tumor [21].

Akibatnya, kami membuat hipotesis bahawa HSA boleh digunakan sebagai pembawa RSS (seperti SNO-HSA) melalui S-sulfihidrasi Cys34-SH. Sebagai sumber polysulfur, DATS dan DMTS terhad kerana lipofilisiti dan turun naiknya. Oleh itu, Na2Sn (Na2S, Na2S2, Na2S3 dan Na2S4) yang tersedia secara komersial telah digunakan dalam kajian ini. Ogasawara et al. Albumin serum terikat sulfur yang disediakan sebelum ini bertindak balas dengan natrium sulfida (NaHS) dengan pencampuran mudah reagen [22]. Sulfur daripada NaHS telah ditambah kepada Cys34 dan penyediaan yang terhasil melindungi kerosakan hati yang disebabkan oleh lipid peroksida. Kami menggunakan kaedah ini untuk menyediakan RSS-tambah-HSA menggunakan Na2Sn untuk penghantaran RSS.

Dalam kerja ini, kami melaporkan penyediaan HSA yang dirawat Na2Sn dan penggunaannya sebagai sistem penyampaian novel RSS. Sulfur yang ditambah telah dianalisis dengan menggunakan probe sulfan sulfur [23] dan penyingkiran sulfida daripada polisulfida [24]. Untuk menilai kesan HSA yang dirawat Na2Sn pada pemutihan kulit, kesan HSA yang dirawat Na2Sn pada sintesis melanin telah dikaji menggunakan garis sel melanoma B16.

2. Bahan dan kaedah

2.1. Bahan

Albumin serum manusia (HSA) telah dibeli dari KAKETSUKEN (Kumamoto, Jepun) dan semua sampel HSA telah dinyahlemak dengan rawatan arang. Natrium sulfida dan natrium tetrasulfida telah dibeli daripada Makmal DOJINDO (Kumamoto, Jepun). Probe sulfur sulfan 4 (SSP4) telah disediakan seperti yang diterangkan sebelum ini [23]. L-DOPA, glutathione, (DTNB), asid askorbik dan reagen Griess satira natrium (sulfanilamide, naphthylethylenediamine-HCl) telah dibeli daripada Nakarai Chemicals (Kyoto, Jepun). Lajur penyahgaraman Sephadex G-25 (φ 1.6 × 2.5 cm) telah dibeli daripada GE Healthcare (Kyoto, Jepun). Medium Eagle diubah suai (DMEM) Dulbecco dan 2,2-diphenyl-1-pi- crylhydrazyl (DPPH) diperoleh daripada Wako Pure Chemical (Osaka, Jepun). Tirosinase cendawan dibeli daripada Sigma-Aldrich. Semua bahan kimia lain adalah gred terbaik yang boleh didapati secara komersial, dan semua penyelesaian disediakan dalam air ternyahion dan suling.

ekstrak cistanche

2.2. Ujian protein BCA

Kepekatan protein diukur menggunakan ujian protein BCA. 10 μL aliquot sampel dan piawaian albumin serum lembu (BSA) diinkubasi dalam 100 μL penimbal tindak balas pada 25 darjah selama 30 minit. Selepas tindak balas, pembaca plat mikro digunakan untuk mengukur penyerapan 540 nm. BSA digunakan untuk membina lengkung piawai.

2.3. Sintesis Na2Sn dirawat-HSA

HSA (300 μM) diinkubasi dengan 1 mM polysulfides natrium (Na2Sn) dalam PBS (pH 7.4) selama 1 jam pada 37 darjah. Selepas tindak balas, lebihan polysulfides natrium dikeluarkan melalui penapisan gel dengan lajur Sephadex G-25.

2.4. Penentuan kadar pengikatan sulfur dengan kaedah penyingkiran untuk sulfida daripada polisulfida (EMSP)

EMSP telah disediakan seperti yang diterangkan sebelum ini (3×EMSP dengan penambahan 792 mg asid L-askorbik kepada 5 mL 3 N NaOH) [24]. Sampel (7.5 μM, 133 μL) diinkubasi dengan 66.7 μL 3 × EMSP selama 3 jam pada 37 darjah . Larutan zink asetat 1 peratus (600 μL) kemudiannya ditambah kepada larutan tindak balas, diikuti dengan vorteks serta-merta. Sampel telah disentrifugasi pada 8,000×g selama 5 minit dan dibasuh dengan garam penimbal fosfat (PBS) dua kali. Selepas mengeluarkan supernatan, air ternyahion dan suling (200 μL) telah ditambah kepada mendakan. Selepas menambah 1 peratus zink asetat (300 μL), 50 μL 20 mM N, N-dimetil-p-phenylenedia-mine dan 20 mM FeCl3 dalam 7.2 N HCl, larutan itu diinkubasi selama 30 minit pada 25 darjah . Sampel telah disentrifugasi pada 8000×g selama 1 minit dan dipindahkan ke dalam 96-plat perigi dan OD pada 665 nm diukur. Na2S digunakan untuk membina lengkung piawai.

2.5. Pengesanan sulfur sulfur dengan SSP4

Setiap sampel (20 μM) diinkubasi dengan 5 μM SSP4 dalam 1 mM Cetyltrimetilammonium Bromide / PBS (pH 7.4) selama 10 minit pada 25 darjah. Selepas pengeraman, pendarfluor diukur oleh spektrofotometer (JASCO Corporation) dengan pengujaan pada 457nm, pelepasan pada 490-535 nm.

2.6. Ujian radikal DPPH

DPPH (250 μM) dalam etanol dicampur dengan jumlah penimbal MES yang sama (50 mM, pH 7.4). HSA yang dirawat Na2Sn (40 μM) adalah ditambah kepada larutan DPPH ini, yang kemudiannya diinkubasi selama 30 minit pada 25 darjah dan penyerapan radikal DPPH diukur pada 540nm. Kadar radikal yang terhapus telah ditukar menggunakan formula berikut;

Radikal tersingkir ( peratus )=(Abssample-Abspbs)/ Abspbs × 100

2.7. Analisis NO dan SNO

HSA yang dirawat Na2Sn (50 μM) diinkubasi dengan penderma NO, NOC7 (200 μM), selama 30 minit pada 25 darjah . Selepas tindak balas, kepekatan NO dan SNO diukur dengan ujian Griess dengan pengubahsuaian kecil [25]. Larutan reagen Griess telah disediakan dengan mencampurkan 0.1 peratus N{10}} Naphtylethylene-diamide dihydrochloride dan 1 peratus sulfanilamide dalam 2 peratus asid fosforik. Penampan tindak balas terdiri daripada 0.1 M NaCl, 0.5 mM DTPA dan 10 mM AcONa・AcOH (pH 5.5). Sampel (20 μM) telah bertindak balas dengan larutan reagen Griess (60 μL) dalam penimbal tindak balas (110 μL) dengan 3 mM HgCl2 dalam 10 mM Na Asetat (pH 5.5). Selepas pengeraman 15 minit, penyerapan 540 nm diukur dengan menggunakan pembaca plat mikro. Nisbah NO/SNO selebihnya ( peratus ) telah dikira dan dibandingkan dengan nilai PBS untuk sampel.

2.8. Kultur sel

Sel melanoma B16 disediakan oleh Bank Sumber Penyelidikan Kanser Jepun (JCRB, Tokyo, Jepun), dan telah dikultur dalam DMEM yang mengandungi 10 peratus serum lembu janin dan larutan antibiotik. Sel ditanam dengan dikekalkan pada 37 darjah dalam udara lembap yang mengandungi 5 peratus CO2 dalam inkubator (nombor laluan 10–20).

2.9. Pengeluaran melanin

Sel melanoma B16 telah disemai dalam 24 plat perigi pada kepekatan 2.5×104 sel/telaga dan dibiakkan di bawah 5 peratus CO2 pada 37 darjah selama 24 jam. Sampel telah dirawat dengan tirosin 0.4mM dan 10mM NH4Cl dalam DMEM yang mengandungi 10 peratus FBS dan kemudian diinkubasi di bawah 5 peratus CO2 pada 37 darjah selama 72 jam. Selepas pengeraman, sel-sel telah dibasuh dua kali dengan PBS dan dibubarkan dalam 1 N NaOH (200 μL). Selepas pengeraman 2 jam pada 60 darjah, penyerapan (405 nm) diukur dengan menggunakan pembaca plat mikro.

Cistanche menghalang pengeluaran melanin.

2.10. sinaran UV

Lampu UV yang dipegang tangan digunakan untuk menyinari sampel pada jarak 5 cm jarak dari plat telaga. Lampu UV ini memberikan keamatan UV masing-masing 614 atau 743 μW/cm2 dengan sinaran 254 nm atau 365 nm dari jarak 5 cm.

2.11. Aktiviti mengais Na2S4-merawat HSA terhadap ROS intraselular, NO, RSS

ROS dan NO dalam sel melanoma B16 diukur oleh setiap probe pendarfluor, CM-H2DCF-DA dan DAF-FM-DA, masing-masing. Sel melanoma B16 telah disemai dalam 96-plat perigi pada kepekatan 1 × 104 sel/telaga dan dikultur dalam 37 darjah, 5 peratus CO2 selama 24 jam. Selepas pengkulturan, media telah dikeluarkan dan digantikan dengan CM-H2DCF-DA (5 μM) atau DAF-FM-DA (10 μM) dalam PBS. Probe diambil oleh sel dengan mengeramkannya pada 37 darjah selama 30 minit. Selepas tindak balas, supernatan dikeluarkan, sampel dicairkan dalam PBS dan pendarfluor diukur serta-merta. Sel telah dipancarkan oleh lampu UV selama 15 minit. Selepas penyinaran, keamatan pendarfluor (Cth. 485 nm, Em. 535 nm) diukur dengan menggunakan pembaca plat mikro pendarfluor.

2.12. Aktiviti tyrosinase cendawan dan pengagregatan melanin

Penyelesaian Tyrosinase dan L-DOPA disediakan dalam PBS (pH 7.4) sejurus sebelum ujian. Tyrosinase, diasingkan daripada cendawan, digunakan untuk memeriksa aktiviti perencatan HSA yang dirawat Na2Sn. Bahagian 20 μL cendawan tyrosinase (537 U/mL) dan 100 μL HSA yang dirawat Na2Sn (40 μM) telah dicampur dengan baik dengan PBS (60 μL) dalam 96 plat perigi dan 20 μL L-DOPA (5 mM) adalah kemudian ditambah. Selepas pengeraman 30 minit, tahap melanin yang disintesis dianalisis dengan mengukur OD 490 nm. Untuk menguji pengagregatan melanin, campuran telah disentrifugasi pada 20,000 g, 15 min selama 3 jam. Anak panah putih menunjukkan bahan agregat. Melanin tidak terkumpul dalam supernatan diukur pada OD 490 nm.

2.13. Ujian keselamatan

Krim topikal yang digunakan dalam kajian ini telah disediakan dengan mencampurkan air (30 mL) Minyak Jojoba (15 mL) dan 5 g lilin pengemulsi pada 60 darjah . Selepas penyejukan, Na2S4-merawat HSA (20 μM) dan penggantungan yang terhasil dicampur dengan baik. Ujian Kerengsaan Kulit dilakukan mengikut Garis Panduan Ujian OECD 439 menggunakan LabCyte Epi-Model (model kulit manusia berbudaya 3D).

2.14. Analisis statistik

Kepentingan statistik data yang dikumpul telah dinilai dengan analisis ANOVA diikuti dengan kaedah Newman-Keuls untuk lebih daripada 2 cara. Perbezaan antara kumpulan telah dinilai dengan ujian-t Pelajar. P < 0.05="" telah="" dianggap="" sebagai="" signifikan="" secara="">

3. Keputusan

3.1. Penyediaan S-sulfidrat HSA

HSA yang dirawat Na2Sn telah disediakan daripada HSA yang telah diinkubasi dengan Na2Sn dan tertakluk kepada penapisan gel selepas tindak balas. Untuk menilai jumlah sulfur sulfur dalam sampel, EMSP, kaedah kuantitatif novel yang kami bangunkan sebelum ini, telah digunakan [24]. Oleh itu, Na2S4- HSA yang dirawat telah disediakan daripada HSA dan Na2Sn dengan membenarkan agen semula bertindak balas selama 1 jam pada 37 darjah . Jumlah natrium polisulfida yang berbeza dibenarkan bertindak balas dengan HSA. Kemudian, sampel HSA diinkubasi dengan larutan EMSP, yang disediakan pada masa penggunaan, selama 3 jam pada 37 darjah. Berdasarkan analisis EMSP, tahap S-sulfidrasi meningkat secara bebas daripada jumlah sulfur (Rajah 1A). Sebaliknya, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1B, rawatan Na2S3- atau Na2S4-meningkatkan keamatan pendarfluor SSP4 (suatu kuar pendarfluor untuk sulfur sulfur) berbanding dengan Na2S- atau Na2S{{24 }}rawatan, menunjukkan bahawa SSP4 berkemungkinan bertindak balas dengan polisulfida protein dalam cara tidak linear (Rajah 1B).

3.2. Antioksidan dan NO kesan menindas HSA yang dirawat Na2S

Kami mengandaikan bahawa HSA yang dirawat Na2Sn akan menyekat pengeluaran melanin kerana aktiviti antioksidannya. Oleh itu, ujian radikal DPPH [26,27] telah dijalankan untuk menganalisis aktiviti antioksidan secara in vitro. Akibatnya, HSA yang dirawat Na2Sn mempunyai kepekatan sulfur tambahan yang jauh lebih tinggi (Rajah 2A). Untuk menjelaskan kesan NO, NOC7 (penderma NO) telah diinkubasi bersama dengan Na2S{11}}HSA yang dirawat pada 25 darjah . Selepas tempoh inkubasi selama 30 minit, kepekatan NO yang tinggal dikira dengan ujian Griess. Seperti yang dilihat dalam bar tertutup Rajah 2B, Na2S4-HSA yang dirawat telah menghasilkan lebih banyak NO berbanding dengan kawalan dan HSA (Rajah 2B). Unsur merkuri (Hg) diketahui dapat mengurangkan SNO dan membebaskan NO2-. Apabila Hg ditambahkan pada larutan Na2S4-HSA yang dirawat, NO2- telah dikeluarkan, menunjukkan bahawa Na2S4- HSA yang dirawat telah dibuang melalui S-nitrosation.

3.3. Melanin menyekat kesan HSA yang dirawat Na2Sn

Sel melanoma tikus B16 telah dikultur dan sintesis melanin digalakkan dengan menambahkan tirosin kepada media. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3, HSA yang dirawat Na2Sn menghalang sintesis melanin dan perencatan adalah bergantung kepada kandungan sulfur. Imej sel sel melanoma B16 selepas penggunaan HSA yang dirawat Na2Sn juga menunjukkan bahawa HSA yang dirawat Na2Sn mengurangkan nisbah pengeluaran melaninsel positif (Rajah 3).

3.4. Kesan antioksidan Na2S4-merawat HSA dengan penyinaran UV

Untuk memeriksa sama ada HSA yang dirawat Na2Sn menindas pembentukan ROS atau NO yang disebabkan oleh UV, ujian tekanan oksidatif telah dilakukan menggunakan sel melanoma B16 sebagai model. Pengeluaran ROS oleh Na2S4-merawat HSA dalam sel melanoma B16 melalui penyinaran dengan 2 peranti UV berbeza selama 15 minit telah diukur oleh CMH2-DCF-DA. Penemuan menunjukkan bahawa HSA yang dirawat Na2S4-menyebabkan penurunan ketara dalam pendarfluor CMH2-DCF-DA kepada PBS dan HSA melalui penyinaran pada 254 nm dan 365 nm (Rajah 4AB). Sebaliknya, HSA yang dirawat Na2S4-juga menyekat pengeluaran NO dalam sel melanoma B16 melalui penyinaran dengan 254 nm UV (Rajah 4CD). Keputusan ini menunjukkan bahawa HSA yang dirawat Na2Sn menyekat sintesis melanin dengan menghalang ROS dan NO yang dihasilkan oleh penyinaran UV.

3.5. Penindasan langsung tyrosinase dan pengagregatan melanin oleh HSA yang dirawat Na2Sn

Sesetengah agen anti-melanin komersial diketahui secara langsung menghalang aktiviti tyrosinase. Oleh itu, kami menguji sama ada HSA yang dirawat Na2Sn mengubah aktiviti tyrosinase. Penemuan menunjukkan bahawa HSA yang dirawat Na2Sn menghalang tirosinase cendawan pada tahap yang lebih tinggi daripada HSA yang tidak dirawat (Rajah 5A). Selepas dijana, melanin mudah mengalami pengagregatan dan mendorong pembentukan medula [28]. Oleh itu, kami seterusnya menangani isu sama ada HSA yang dirawat Na2Sn menghalang pengagregatan melanin. Akibatnya, apabila tyrosinase dan L-DOPA diinkubasi bersama selama 3 jam, pigmen melanin menjadi terkumpul, tetapi HSA yang dirawat Na2Sn menghalang pengagregatan (Rajah 5B). Di satu pihak, HSA juga didapati menghalang pengagregatan, menunjukkan bahawa HSA sendiri boleh menghalang pengikatan L-DOPA kepada tyrosinase.

3.6. Ujian keselamatan HSA yang dirawat Na2Sn menggunakan kulit manusia berbudaya 3D

Ujian kerengsaan kulit untuk HSA yang dirawat Na2S4-dilakukan menggunakan sel kulit manusia kultur 3D mengikut garis panduan OECD. Akibatnya, bilangan sel yang masih hidup tidak dikurangkan oleh Na2S4-HSA yang dirawat dengan/tanpa menggunakan krim topikal (Rajah 6A). Penggunaan kit pengesanan sitotoksisiti LDH juga mendedahkan bahawa sel kulit tidak rosak oleh HSA yang dirawat Na2S4-(Rajah 6B). Data ini menunjukkan bahawa HSA yang dirawat Na2Sn adalah sangat selamat untuk digunakan terhadap kulit manusia di bawah kepekatan yang diperiksa dalam kajian ini.

4. Perbincangan

Melanin disintesis oleh pengoksidaan tirosin. Tyrosine dioksidakan kepada L-DOPA, dan kemudian dopaquinone oleh tindakan tyrosinase. Dopaquinone secara spontan teroksida kepada melanin. Melanin mendorong pembentukan pigmen hitam dan jeragat, tetapi juga memainkan peranan dalam melindungi kulit daripada rosak akibat sinaran UV. Dalam kulit manusia, melanosit menghasilkan ROS dan NO apabila dirangsang oleh sinaran UV [2,29,30]. ROS menggalakkan sintesis melanin dengan mengaktifkan tyrosinase melalui tindakan ATP synthase, phenylalanine hydroxylase, dan fosforilasi MAPKs [31,32]. NO mengaktifkan tyrosinase melalui peningkatan tahap selular cGMP [6]. Oleh itu, ROS dan NO sca- vengers dianggap sebagai agen anti-melanogenesis. Di sini, kami menyiasat kesan sintesis anti-melanin HSA yang dirawat Na2Sn. HSA yang dirawat Na2Sn sangat menekan paras selular ROS dan NO yang dihasilkan oleh sinaran UV (Rajah 4). Tambahan pula, HSA yang dirawat Na2Sn mempunyai kesan langsung ke atas menghalang tindakan tyrosinase (Rajah 5A) dan pengagregatan melanin (Rajah 5B). Kami tidak dapat menjelaskan mekanisme bagaimana sulfur sulfur dipindahkan daripada HSA yang dirawat Na2Sn ke sel. Oleh itu, sifat bagaimana kesan langsung fungsi HSA yang dirawat Na2Sn masih tidak jelas. Yamashita et al. menunjukkan bahawa dopaquinone mengikat protein tiol melalui sisa sistein [33]. Secara keseluruhan, perencatan pengagregatan melanin oleh HSA dan HSA yang dirawat Na2Sn juga mungkin melibatkan pembentukan ikatan disulfida dengan dopaquinon atau melanin. Sebaliknya, perencatan tyrosinase bergantung kepada kandungan sulfur tambahan (Rajah 5A). GSH diketahui mengikat tyrosinase dan mengurangkan aktivitinya [34]. Oleh kerana sistein S-sulfihidrat mempunyai kereaktifan yang lebih kuat daripada sistein biasa [11], glutathione persulfide (GSSH) boleh menghalang tindakan tyrosinase lebih daripada GSH. Kajian lanjut mengenai isu sama ada HSA yang dirawat Na2Sn meningkatkan GSSH intraselular diperlukan pada masa hadapan.

ROS dihasilkan oleh penyinaran UV atau tekanan luaran yang mendorong tanda-tanda penuaan, bukan sahaja dalam bentuk sintesis melanin tetapi juga oleh penampilan kedutan dan kulit kendur, yang disebabkan oleh kerosakan DNA dan pembentukan kolagen bersilang. Ia juga diketahui bahawa ROS adalah faktor yang memburukkan dalam pelbagai jenis keradangan seperti jerawat dan psoriasis. Pelbagai agen pemutih kulit, seperti asid traneksamik [35] dan arbutin [36], telah direka untuk menangani isu ini. Walau bagaimanapun, sebatian ini hanya menghalang sintesis melanin dan tidak mempunyai kesan ke atas tekanan oksidatif. Oleh itu, risiko ketoksikan yang disebabkan oleh ROS kekal. Satu kelebihan menggunakan HSA yang dirawat Na2Sn ialah ia memusnahkan ROS dengan cekap (Gamb. 2 dan 4).

Hidrogen sulfida telah dikaji sebagai molekul penting ketiga selepas nitrik oksida dan karbon monoksida. Kesan terapeutik hidrogen sulfida telah terbukti boleh digunakan untuk rawatan iskemia/reperfusi [37], aterosklerosis [38], sepsis [39] dan ketoksikan yang disebabkan oleh diet lemak tinggi [40]. Selain itu, hidropersulfida mempunyai aktiviti yang lebih tinggi daripada hidrogen sulfida. Sebagai contoh, Na2S4 berkesan menyahtoksik metil merkuri dan menghalang pembezaan sel neuroblastoma, manakala Na2S tidak [12,41]. Oleh itu, bukan sahaja kesan pemutihan kulit tetapi juga kesan positif lain HSA yang dirawat Na2Sn adalah mungkin.

Kesimpulannya, kami melaporkan pembangunan sistem penghantaran RSS novel menggunakan albumin serum sebagai pembawa yang stabil. Sulfur reaktif, apabila digabungkan dengan HSA, mempunyai kesan anti-oksidan yang lebih kuat daripada HSA dan menghalang sintesis melanin dalam sel melanoma. Mekanisme anti-melanogenesis melibatkan bukan sahaja ROS dan NO scavenging, tetapi juga penindasan aktiviti tyrosinase dan agregasi melanin. Oleh itu, HSA yang dirawat Na2Sn mempunyai potensi besar untuk digunakan sebagai agen pemutih kulit yang selamat.

Ini adalah produk kami.

Untuk maklumat lanjut, sila klik gambar.