Novel Netrin-1-Peptida Terhasil Meningkatkan Perlindungan Terhadap Kematian Neuronal Dan Mengurangkan Pendarahan Intracerebral dalam Tikus Bahagian 3

Kumpulan rawatan salin, TAT atau TE1 (larut dalam salin) diberikan kepada tikus 2 haafter ICH dan setiap hari selama 5 hari melalui suntikan intraperitoneal pada jumlah isipadu 0.1 mLper haiwan. Peptida diberikan secara buta pada dos 12 mg/kg.

Salin fisiologi ialah penimbal fisiologi yang biasa digunakan, digunakan secara meluas dalam eksperimen perubatan dan biologi. Tetapi adakah anda tahu? Salin fisiologi juga boleh meningkatkan daya ingatan kita!

Pertama sekali, garam fisiologi memainkan peranan penting dalam fungsi normal sel. Ia boleh mengekalkan tekanan osmosis sel normal dan mengekalkan morfologi dan fungsi normal sel. Di dalam otak, sejumlah besar sel saraf memerlukan garam fisiologi sebagai bahan asas, dan suplemen garam fisiologi boleh menggalakkan operasi normal sel-sel otak, menyediakan oksigen dan nutrien yang mencukupi untuk otak, dan menjadikan otak lebih sihat.

Kedua, garam fisiologi boleh menggalakkan penghantaran isyarat antara neuron otak dan meningkatkan keupayaan pembelajaran otak. Kajian telah menunjukkan bahawa dalam proses pembelajaran tugasan, suntikan garam fisiologi boleh meningkatkan kesan pembelajaran pelajar dengan ketara, dan meningkatkan keadaan emosi pelajar, mengurangkan kebimbangan dan tekanan pembelajaran. Pada masa yang sama, garam fisiologi juga boleh meningkatkan bilangan neuron dan kerumitan neuron dalam hippocampus, yang kondusif untuk pembentukan dan penyelenggaraan ingatan.

Di samping itu, garam fisiologi boleh meningkatkan persekitaran metabolik otak dan mengurangkan pelbagai kesan berbahaya pada otak, seperti kerosakan, lesi, iskemia, dan hipoksia. Ini adalah faktor yang boleh menyakiti otak, dan suntikan garam fisiologi boleh meningkatkan keupayaan mengatasi otak dan mengurangkan kerosakannya, dengan itu meningkatkan daya ingatan dan keupayaan berfikir otak.

Secara umum, garam adalah bahan yang ideal untuk meningkatkan daya ingatan. Ia boleh mempunyai pelbagai kesan positif pada otak, termasuk meningkatkan bilangan dan kerumitan neuron, meningkatkan persekitaran metabolik, dan menggalakkan penghantaran isyarat antara neuron. Oleh itu, apabila kita perlu meningkatkan ingatan kita, kita juga boleh mempertimbangkan untuk menyuntik garam untuk memberikan perlindungan dan sokongan yang lebih baik untuk otak kita. Ia boleh dilihat bahawa kita perlu meningkatkan ingatan kita, dan Cistanche boleh meningkatkan ingatan kita dengan ketara kerana ia juga boleh mengawal keseimbangan neurotransmitter, seperti meningkatkan tahap asetilkolin dan faktor pertumbuhan, yang sangat penting untuk ingatan dan pembelajaran. Selain itu, Cistanche juga boleh meningkatkan aliran darah dan menggalakkan penghantaran oksigen, yang dapat memastikan otak memperoleh nutrisi dan tenaga yang mencukupi, seterusnya meningkatkan daya hidup dan daya tahan otak.

Klik tahu cara untuk meningkatkan ingatan anda

4.13. Model Tetikus Aruh Kolagenase ICH

Suntikan kolagenase biasanya digunakan untuk mendorong ICH [60]. Tikus C57BL/6 jantan (umur 8 hingga 12 minggu) telah dibius dengan isoflurane (2 hingga 5%) dan diletakkan pada kerangka stereotaksik.

Semasa prosedur, suhu badan setiap haiwan dikekalkan pada 37 ◦C dengan selimut homeotermik. Menggunakan instrumen stereotaxic (Ruiwode Life ScienceCo., Ltd., Shenzhen, China) dan picagari (Hamilton Company, Reno, NV, USA), 0.3 µLof collagenase (0.{{12 }}45 IU; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, Amerika Syarikat) telah diselitkan ke dalam striatum kanan (AP: +0.2 mm; ML: −2.3 mm; DV: −3.5 mm) pada kadar aliran sebanyak 0.1 µL/min.

Sejumlah 0.3 µL garam dimasukkan ke dalam haiwan kawalan. Semua prosedur pembedahan telah dijalankan di bawah keadaan aseptik. Dalam kajian ini, lebih 66 tikus jantan telah digunakan, dan haiwan tersebut secara rawak diberikan kepada kumpulan sebelum setiap eksperimen [57].

4.14. Analisis Tingkah Laku

Analisis tingkah laku neurologi tikus selepas pembentukan hematoma otak telah dikesan oleh ujian penyingkiran pita pelekat [61] dan ujian silinder [60]. Ujian taperemoval pelekat dilakukan dengan meletakkan pita pelekat pada kawasan penanam setiap kaki depan (kanan dan kiri) tikus.

Setiap tetikus diletakkan di dalam sangkar novel.

Masa dari pita itu digunakan apabila tetikus berjaya mengeluarkannya telah direkodkan untuk setiap kaki. Maksimum 300 s dibenarkan untuk setiap kaki. Di antara eksperimen, haiwan itu ditempatkan di dalam sangkar rumah mereka di kemudahan bebas patogen.

Ujian silinder dilakukan dengan meletakkan tetikus dalam silinder kaca akrilik lutsinar (diameter: 8 cm; tinggi: 25 cm) di hadapan 2 cermin dan kamera selama 5 minit. Kamera diletakkan secara berpusat di hadapan 2 cermin dan silinder untuk mendapatkan video yang optimum.

Untuk penilaian penggunaan kaki depan bebas, (1) keupayaan tikus untuk menghubungi dinding silinder dengan satu kaki depan semasa pemeliharaan penuh dan (2) keupayaan tikus untuk mendarat dengan hanya satu kaki depan di atas lantai selepas pemeliharaan penuh dinilai. Sekurang-kurangnya 20 titik hubungan untuk setiap kaki depan dikira menggunakan gerakan perlahan.

Untuk analisis garis dasar sebelum pembedahan, ujian dilakukan dua kali setiap tetikus dengan rehat 1 jam antara ujian. Forelimbuse dinyatakan sebagai nisbah penggunaan kaki depan bebas sebelah kanan ke kiri.

4.15. Analisis Isipadu Hematoma

Untuk menentukan sama ada rawatan mengurangkan jumlah hematoma, tikus dikorbankan 5 hari selepas ICH; otak telah dikeluarkan dan kilat beku dalam OCT. Bahagian koronal dihiris pada ketebalan 30 µm dan diletakkan terus pada slaid kaca. Untuk mengukur isipadu hematoma, bahagian tersebut telah didigitalkan pada tahap koronal piawai.

Pengguna buta mengukur kontur dan hematoma di hemisfera kiri dan kanan dalam setiap bahagian. Isipadu hematoma dan bengkak diukur dan dikira menggunakan ImageJ (NIH).

Sekurang-kurangnya 5 otak setiap kumpulan tertakluk kepada pengukuran hematoma, dan hematomavolum diukur di seluruh otak.

4.16. Pewarnaan Fluoro-Jed C

Neurodegenerasi pada tikus berikutan ICH yang disebabkan oleh kolagenase dinilai dengan mengotorkan dengan Kit Pewarnaan Sedia-untuk-Dilute Fluoro-jed C (TR-100-FJT, Biosensis, Thebarton, Australia) mengikut protokol pengeluar [62].

Secara ringkas, tikus kawalan dan tikus ICH (± ip peptida) telah dikorbankan 5 hari selepas pemodelan, dan otak telah diproses mengikut protokol yang digunakan untuk eksperimen imunositokimia.

Bahagian otak terapung direndam dalam larutan natrium hidroksida 1% selama 5 minit, dibilas selama 2 minit dalam 70% etanol, dan kemudian dibilas selama 2 minit dalam air suling. Seterusnya, bahagian terapung direndam dalam larutan kalium permanganat 0.06% (KMnO4 dalam air suling) selama 10 minit.

Bahagian itu dibasuh dengan ddH2O sebelum direndam dalam 0.0001% larutan pewarna Fluoro-jed (Fluoro-jed C dalam air suling) selama 20 minit dengan goncangan lembut dalam gelap.

Bahagian itu dibasuh dengan ddH2O, dipasang pada slaid bersalut, dan dikeringkan pada suhu bilik semalaman dalam gelap. Pewarnaan Fluoro-Jade C dalam kawasan perihematomal telah diperiksa menggunakan mikroskop confocal Zeiss LSM 880. Kuantiti Cstaining Fluoro-jed dilakukan menggunakan perisian ImageJ.

4.17. Imunofluoresensi Tisu

Pewarnaan imunofluoresensi tisu dilakukan menggunakan satu siri 30-µm-bahagian tebal. Bahagian diinkubasi dengan antibodi utama berikut: antiNeuN tikus (1:500, Millipore, MAB377, Billerica, MA, Amerika Syarikat) atau antibodi anti-GFAP tetikus (1:200, SigmaAldrich, G3893, St Louis, MO, Amerika Syarikat) pada 4 ◦C semalaman. Selepas mencuci dengan PBS, bahagian kemudiannya diinkubasi dengan antibodi Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-tikus (1:1000;Invitrogen, A21202, Carlsbad, CA, USA).

4.18. Ujian TUNEL

Ujian terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end-labelling (TUNEL) assay digunakan untuk mengenal pasti sel apoptosis dengan pemecahan DNA nuklear di kawasan perihematomal otak.

Pewarnaan dilakukan menggunakan kit ujian apoptosis one-stepTUNEL komersial (Beyotime, C1090, Nanjing, China) dan dilakukan mengikut arahan pengilang. Berikutan imunofluoresensi tisu, TUNELreaction telah dilakukan.

Bahagian otak diinkubasi dengan campuran tindak balas TUNEL (1 jam pada37 ◦C), dan kemudian bahagian itu dibasuh dengan PBS dan diwarnakan dengan DAPI. Penyetempatan bersama pewarnaan NeuN-TUNEL telah diperiksa menggunakan mikroskop confocal Zeiss LSM 880.

Neuron TUNEL-positif (NeuN positif) di kawasan perihematomal di dalam striatum dikira menggunakan perisian ImageJ pada tiga gambar berbeza setiap tetikus yang diambil di bawah objektif 20X. Kolokalisasi pewarnaan GFAP-TUNEL adalah serupa dengan pewarnaan NeuN-TUNEL.

4.19. Ujian Kebolehtelapan Penghalang Darah-Otak Vivo

Dalam Vivo, Ujian Kebolehtelapan Penghalang Darah telah dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini [63-65]. Secara ringkas, tikus kawalan dan tikus ICH (±ip peptida) disuntik secara intraperitoneal dengan dextran 4 kDa berlabel FITC (100 µL daripada 2 mM stok dalam PBS, Sigma Aldrich,46944-100 MG-F, St Louis, MO, Amerika Syarikat) selepas pemodelan 5 hari, diikuti dengan bius 5 minit kemudian.

Selepas masa edaran selama 10 minit untuk pengesan, haiwan telah disediakan untuk perfusi transcardial, dan ~ 300 μl darah dikumpulkan dari rongga dada sejurus selepas atrialpuncture, diikuti dengan perfusi selama 3 minit dengan PBS. Hemibrain (bebas daripada lobus olfaktori, otak kecil, dan otak belakang) dan satu buah pinggang telah dikumpulkan dan segera membekukan nitrogen tak cair dan disimpan pada suhu -80 ◦C.

Untuk pengukuran pendarfluor, sampel dicairkan ais, ditimbang dan dihomogenkan dalam PBS (400 µL untuk hemiserebrum dan 600 µL untuk buah pinggang), diikuti dengan sentrifugasi selama 20 minit pada 4 ◦C dan 15,000× g.

Supernatan (100 µL), serta jumlah serum yang sama (1/5 pencairan dalam PBS), telah dimuatkan ke dalam 96-plat hitam telaga, dan pendarfluor diukur pada pengujaan (490 nm)/pancaran (520 nm) yang sepadan ) dalam pembaca plat (Tecan, Männedorf, Switzerland). Haiwan palsu (tanpa penyuntikan) digunakan untuk menolak nilai autofluoresensi. Indeks kebolehtelapan (mL/g) dikira sebagai nisbah RFU tisu/g berat tisu kepada serum RFU/mL serum.

4.20. Pewarnaan Lektin Pendarfluor

Untuk menggambarkan saluran mikro otak, kami menggunakan Lycopersicon esculentum lectin terkonjugasi fluorescein (1:200, Vector Laboratories, FL-1171, Burlingame, CA, USA) untuk merendam bahagian terapung selama 1 jam.

Bahagian telah diimej pada mikroskop confocal Zeiss LSM 880 di bawah objektif 20x, dan imej telah diproses dengan tetapan 1.3 gamma. Tiga imej telah diambil dari 3 kawasan yang telah ditetapkan di kawasan perihematomal dari koronal otak peranimal. Titik cawangan kapal dikira dalam setiap otak oleh penyiasat yang buta. Titik cawangan ditakrifkan sebagai satu vesel berlabel fluorescein dengan ketara memisahkan kepada2 trek kapal yang berbeza dan berasingan [66].

4.21. Analisis Statistik

Semua prosedur eksperimen dijalankan secara buta dan dilakukan 3 kali secara bebas seperti yang diterangkan sebelum ini [67]. Data dibentangkan sebagai min ± SEM. Analisis statistik dilakukan oleh ANOVA Sehala, ANOVA Dua hala dan Ujian Pelajar, mengikut kesesuaian, menggunakan GraphPad Prism v7 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA ) dan perisian SPSS versi 20.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA).

Parameter statistik boleh didapati dalam legenda angka yang berkaitan. Kepentingan statistik telah ditetapkan pada *p < {{0}}.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001; **** p < 0.0001.]

5. Kesimpulan

Domain EGF3 Netrin-1 adalah penting untuk interaksi Netrin-1 dengan DCC dan boleh mengaktifkan laluan isyarat yang berbeza. Peptida E1 yang dipotong daripada Netrin-1 (sisa 407–422)berinteraksi dengan DCC untuk melindungi neuron daripada ketoksikan yang disebabkan oleh hemin.

Penggunaan peptida E1 meningkatkan pemulihan fungsi dalam model eksperimen ICH. Tambahan pula, peptida E1 boleh melindungi neuron daripada degenerasi dan apoptosis selepas ICH.

Sumbangan Pengarang: Pengkonsepan, LL, Z.-XH dan X.-JZ; metodologi, LL, K.-JL danJ.-BC; pengesahan H.-LY dan X.-XH; penyiasatan, X.-JZ; penyusunan data, JY; sumber LL danZ.-XH; menulis LL, Z.-XH dan X.-JZ; penyeliaan, Z.-XH, X.-JZ; pemerolehan pembiayaan, Z.-XHand X.-JZ Semua pengarang telah membaca dan bersetuju dengan versi manuskrip yang diterbitkan.

Pembiayaan: Penyelidikan ini dibiayai oleh Yayasan Sains Semula Jadi Kebangsaan China (31671065dan 32071018), Rancangan Pembangunan Sains dan Teknologi Wilayah Jilin (202520YY01017404).

Penyata Lembaga Semakan Institusi: Semua prosedur telah diluluskan oleh Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Institusi Universiti Normal Timur Laut (NENU/IACUC, AP2016200299). Piawaian Kebangsaan Republik Rakyat China (GB/T 35892–2018), Garis Panduan Haiwan Makmal untuk Kajian Etika Kebajikan Haiwan, adalah panduan untuk penjagaan dan protokol haiwan kami.

Kenyataan Persetujuan Termaklum: Tidak berkenaan.

Penghargaan: Kerja ini disokong oleh Yayasan Sains Semula Jadi Kebangsaan China(31671065 dan 32071018) dan, Pelan Pembangunan Sains dan Teknologi Wilayah Jilin (202520YY01017404).

Konflik Kepentingan: Pengarang mengisytiharkan tiada konflik kepentingan. Pembiaya tidak mempunyai peranan dalam reka bentuk kajian; dalam pengumpulan, analisis, atau tafsiran data; dalam penulisan manuskrip, atau dalam keputusan untuk menerbitkan hasilnya.

Rujukan

1. Kirshner, HS Pengurusan perubatan pendarahan intracerebral: Kembali kepada asas. Int. J. Clin. Berlatih. 2008, 62, 521–522.[CrossRef] [PubMed]

2. Anderson, CS; Heeley, E.; Huang, Y.; Wang, J.; Stapf, C.; Delcourt, C.; Lindley, R.; Robinson, T.; Lavados, P.; Neal, B.; et al. Penurunan tekanan darah yang cepat pada pesakit dengan pendarahan intracerebral akut. N. Inggeris. J. Med. 2013, 368, 2355–2365. [CrossRef][PubMed]

3. Qureshi, AI; Mendelow, AD; Hanley, DF Pendarahan intracerebral. Lancet (Lond. Engl.) 2009, 373, 1632–1644. [CrossRef]

4. Simpan, RF; Hua, Y.; Xi, G. Pendarahan intracerebral: Mekanisme kecederaan dan sasaran terapeutik. Neurol Lancet. 2012, 11,720–731. [CrossRef]

5. Schrag, M.; Kirshner, H. Pengurusan Pendarahan Intracerebral: Seminar Fokus JACC. J. Am. Coll. Kardiol. 2020, 75, 1819–1831.[CrossRef] [PubMed]

6. Kandasamy, R.; Idris, Z.; Abdullah, JM Pembedahan Pendarahan Intracerebral. Dalam Pembedahan Neurovaskular Pendekatan Pembedahan untuk Penyakit Neurovaskular; Julai, J., Wahjoepramono, EJ, Eds.; Springer: Singapura, 2019; ms 201–210.7. Broughton,

7. Broughton, BR; Reutens, DC; Sobey, CG Mekanisme apoptosis selepas iskemia serebrum. Strok 2009, 40, e331–e339. [CrossRef][PubMed]

8. Kristiansen, M.; Graversen, JH; Jacobsen, C.; Sonne, O.; Hoffman, HJ; Undang-undang, SK; Moestrup, SK Pengenalpastian reseptor penghapus haemoglobin. Alam 2001, 409, 198–201. [CrossRef]

9. Madangarli, N.; Bonsack, F.; Dasari, R.; Sukumari-Ramesh, S. Intracerebral Hemorrhage: Komponen Darah dan Neurotoxicity.Brain Sci. 2019, 9, 316. [CrossRef]

10. Deiner, MS; Kennedy, TE; Fazeli, A.; Serafini, T.; Tessier-Lavigne, M.; Sretavan, DW Netrin-1 dan DCC mengantara bimbingan akson secara setempat pada cakera optik: Kehilangan fungsi membawa kepada hipoplasia saraf optik. Neuron 1997, 19, 575–589. [CrossRef]

11. Kennedy, TE; Serafini, T.; de la Torre, JR; Tessier-Lavigne, M. Netrins ialah faktor kemotropik yang boleh disebarkan untuk akson komisural dalam saraf tunjang embrio. Sel 1994, 78, 425–435. [CrossRef]

12. Flores, C. Peranan netrin-1 dalam organisasi dan fungsi sistem dopamin mesocorticolimbic. J. Psikiatri Neurosci. Jpn.2011, 36, 296–310. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com