Novel Netrin-1-Peptida Terhasil Meningkatkan Perlindungan Terhadap Kematian Neuronal Dan Mengurangkan Pendarahan Intracerebral pada Tikus Bahagian 1

Abstrak:

Telah dilaporkan bahawa Netrin-1 terlibat dalam perlindungan saraf berikutan kecederaan pada sistem saraf pusat. Walau bagaimanapun, domain berfungsi minimum Netrin-1 yang boleh mengekalkan perlindungan euro tetapi mengelakkan kesan sampingan utama Netrin masih sukar difahami.

Sistem saraf pusat adalah salah satu sistem saraf yang paling penting dalam tubuh manusia, yang mengawal pemikiran, perasaan, dan tindakan manusia. Apabila sistem saraf pusat rosak, ingatan manusia juga akan terjejas. Tetapi jangan risau, kita boleh mengambil beberapa cara positif untuk membantu memulihkan ingatan.

Pertama, anda perlu memahami kesan kerosakan ingatan. Kerosakan pada sistem saraf pusat boleh menjejaskan kebolehan kognitif, proses berfikir, dan perhatian orang, yang semuanya secara langsung mempengaruhi ingatan orang. Selain itu, kerosakan pada sistem saraf pusat juga boleh menyebabkan ketidakstabilan emosi, menjadikan orang lebih terdedah kepada panik, kebimbangan, dan kemurungan, sekali gus menjejaskan pemulihan ingatan.

Walau bagaimanapun, walaupun kerosakan pada sistem saraf pusat boleh membawa beberapa kesan negatif, kita boleh mengambil beberapa langkah positif untuk menggalakkan pemulihan ingatan. Pertama, kita boleh mencuba beberapa latihan kognitif, seperti membaca, menulis, dan menyelesaikan teka-teki. Aktiviti ini boleh merangsang otak untuk menghasilkan neuron baru dan membantu otak membina ingatan dan cara berfikir yang baru.

Kedua, kita juga boleh menggalakkan pemulihan ingatan melalui beberapa senaman fizikal. Kajian telah menunjukkan bahawa senaman yang betul boleh merangsang otak untuk menghasilkan neuron baru dan sambungan neuron dan menggalakkan pemprosesan maklumat baru oleh otak. Inilah sebabnya mengapa sesetengah orang tiba-tiba datang dengan idea yang baik atau menyelesaikan masalah yang sukar semasa berlari atau berjalan.

Akhir sekali, kita perlu memberi perhatian kepada peranan pengambilan nutrisi yang betul terhadap ingatan. Fungsi normal otak memerlukan beberapa nutrien yang diperlukan, seperti protein, vitamin, dan unsur surih. Jika makanan kita kekurangan zat ini, ia akan menjejaskan daya ingatan dan daya pemikiran kita. Oleh itu, kita harus memilih beberapa makanan yang kaya dengan nutrien ini dalam diet kita, seperti ikan, daging tanpa lemak, sayur-sayuran, dan buah-buahan.

Ringkasnya, kerosakan pada sistem saraf pusat akan memberi kesan tertentu pada ingatan orang, tetapi kita boleh menggalakkan pemulihan ingatan melalui latihan kognitif yang betul, senaman fizikal, dan kawalan diet. Saya berharap semua orang dapat menghadapi cabaran dalam hidup secara positif, mengekalkan sikap optimis, dan berusaha untuk memulihkan sistem saraf pusat yang sihat dan ingatan yang baik. Ia boleh dilihat bahawa kita perlu meningkatkan ingatan, dan Cistanche boleh meningkatkan daya ingatan dengan ketara kerana Cistanche adalah ubat tradisional Cina dengan banyak kesan unik, salah satunya adalah untuk meningkatkan daya ingatan. Keberkesanan Cistanche berasal dari pelbagai bahan aktif yang terkandung di dalamnya, termasuk asid tannic, polisakarida, glikosida flavonoid, dan lain-lain, yang boleh menggalakkan kesihatan otak dalam pelbagai cara.

Klik Tahu untuk meningkatkan ingatan jangka pendek

Di sini, kami menyiasat kesan europrotektif peptida E1 yang diperoleh daripada domain EGF3 Netrin{1}} (sisa 407–422). Kami mendapati bahawa ia berinteraksi dengan karsinoma kolorektal (DCC) yang dipadamkan untuk mengaktifkan fosforilasi kinase lekatan fokus yang mempamerkan perlindungan saraf.

Pentadbiran peptida E1 dapat meningkatkan pemulihan fungsi melalui pengurangan apoptosis dalam model murine eksperimen intracerebralhemorrhage (ICH).

Ringkasnya, kami mendedahkan urutan berfungsi Netrin-1 yang terlibat dalam proses penemuannya selepas ICH dan mengenal pasti calon peptida untuk rawatan ICH.

Kata kunci: pendarahan intracerebral; hemin; perlindungan saraf; Netrin-1; peptida.

1. Pengenalan

Pendarahan intracerebral (ICH) ialah subtipe strok yang dahsyat dengan kadar kematian dan morbiditi yang tinggi [1–3] yang melibatkan pecah abnormal saluran darah serebrum di dalam otak [4,5].

Penyingkiran hematoma secara pembedahan lebih disukai untuk mencapai hemostasis dan melegakan tekanan intrakranial [6]. Walau bagaimanapun, sisa hematik dan produk pecahan darah masih boleh menggalakkan kecederaan otak sekunder berikutan ICH, mendorong kerosakan saraf dan melambatkan pemulihan fungsi [7-9].

Oleh itu, pembangunan strategi berkesan yang menyasarkan kerosakan neuron akibat kecederaan otak sekunder akan bermanfaat untuk rawatan strok. Netrin-1 ialah salah satu protein yang paling dikaji yang mengawal bimbingan akson dan sinaptogenesis [10–12] melalui interaksi dengan reseptornya dipadamkan dalam kanser kolorektal (DCC) dan UNC5H (homolog-5 tidak selaras) untuk mengaktifkan kemandirian sel, pembezaan dan percambahan [13–15].

Reseptor mendorong isyarat kematian untuk mengantara apoptosis apabila Netrin-1 tiada [16]. Adalah diketahui bahawa pengikatan Netrin-1 dengan DCC menghasilkan dimerisasi DCC dan memulakan tirosin 861 fosforilasi focal adhesionkinase (FAK) untuk mendorong pertumbuhan neurit dan bimbingan akson [17,18].

Pengikatan Netrin-1 dengan DCC melibatkan domain EGF3 Netrin-1 dan domain FN5 DCC dalam pengaktifan laluan isyarat Netrin-1 [19,20]. Baru-baru ini, Netrin-1 telah ditunjukkan untuk memberikan kesan perlindungan saraf di kawasan iskemia [21].

Tahap ekspresi serum Netrin-1, yang menghalang apoptosis sel dan menggalakkan penjanaan semula neuron, berkorelasi positif dengan pemulihan pesakit daripada strok iskemia [22,23].

Menariknya, pemindahan sel stem mesenchymal sumsum tulang yang merembeskan Netrin-1 ke dalam saraf sciatic tikus yang rosak memulakan penjanaan semula axonal [24] dan mengurangkan kematian neuron motor [25]. Suntikan stereotaksik protein Netrin-1 ke dalam ventrikel mengurangkan kematian sel saraf selepas pendarahan subarachnoid melalui pengaktifan isyarat DCC/APPL1/AKT [26].

Polipeptida yang diperoleh daripada domain EGF3 Netrin-1 (asid amino 423–433) dengan ketara mengaktifkan fosforilasi ERK dan menggalakkan penghasilan NO, yang mempunyai kesan kardioprotektif [27,28]. Walau bagaimanapun, Netrin-1 telah dikenal pasti sebagai biomarker yang berpotensi untuk tumorigenesis [29–31] kerana pengawalseliaan status Netrin-1 ditemui dalam pelbagai kanser yang berasal dari tisu [32].

Apabila Netrin-1 terikat kepada reseptorDCC atau Unc5Hnya, reseptor tersebut menghantar isyarat positif yang membawa kepada kemandirian, keradangan, angiogenesis dan anti-apoptosis, yang seterusnya mengawal tumorigenesis [31].

Oleh itu, adalah sangat penting untuk mengenal pasti domain berfungsi minimum Netrin-1 yang boleh memelihara neuroprotection dan mengelakkan kesan sampingan utama Netrin-1.Di sini, kami mendapati bahawa peptida E1 (residu 407–422), yang diperoleh daripada domain EGF3 Netrin-1, berinteraksi dengan DCC untuk melindungi neuron daripada ketoksikan yang disebabkan oleh hemin.

Model eksperimen tikus ICH Inan, penggunaan peptida E1 meningkatkan pemulihan fungsi, seperti yang ditentukan oleh ujian tingkah laku. Tambahan pula, peptida E1 boleh menghalang neuron daripada merosot selepas ICH.

Berdasarkan keputusan ini, kami mengenal pasti urutan fungsi Netrin-1 yang terlibat dalam pemulihan selepas ICH dan menentukan bahawa peptida ini boleh digunakan untuk rawatan ICH.

2. Keputusan

2.1. Domain EGF3 Penting untuk Interaksi Netrin-DCC

Netrin-1 terdiri daripada domain VI, tiga ulangan EGF dan domain terminal-C [33]. Struktur kristal kompleks Netrin-1/DCC manusia mendedahkan bahawa domain Netrin-1 EGF3 adalah penting untuk interaksi Netrin-1/DCC, tetapi bukan domain EGF1 dan EGF2 [34].

Mutagenesis sisa asid amino utama (His407, Gln442, atau Gln443) pada domain EGF3 mengganggu sepenuhnya pengikatan Netrin-1/DCC [19]. Domain EGF1/2 diperlukan untuk menukar isyarat yang menarik kepada isyarat yang menjijikkan apabila Unc5 wujud bersama DCC [20].

Oleh itu, kami mula-mula menjana binaan penuh dan EGF3-dipadamkan (Netrin-1 ∆407–443) Netrin-1 binaan (Rajah 1A) dan secara sementara menyatakan binaan ini dalam sel HEK293T berbudaya untuk GSTpulldown .

Pengikatan diperhatikan untuk binaan yang menyatakan Netrin-1 tetapi bukan Netrin-1(∆407–443) (Rajah 1C). Keputusan ini menunjukkan bahawa domain EGF3 yang mengandungi asid amino 407–443 bertanggungjawab untuk interaksi Netrin-1 dengan DCC. Untuk menyiasat peranan domain EGF3 dalam Netrin-DCC, kami mula-mula memurnikan myc-taggedNetrin{{12 }} atau Netrin dipenggal-1 (∆407–443) (Rajah 1B).

Seterusnya, sel HEK293T telah ditransfeksi dengan plasmid yang membawa cDNA DCC dan diinkubasi dengan protein Netrin-1, dan kemudian pengikatan Netrin-1 dinilai dengan imunostaining.

Kami mendapati bahawa Netrin penuh-1, tetapi tidak dipotong Netrin-1, dapat mengikat DCC pada membran plasma (Rajah 1D). Untuk menentukan sama ada domain EGF3 boleh berinteraksi dengan DCC, kami menghasilkan konstruk GST-EGF3 untuk menurunkan sel-sel lisis yang mengekspresikan DCC secara berlebihan. Kami memerhatikan pengikatan khusus DCC dengan GST-EGF3 (Rajah 1E).

Tambahan pula, kami mensintesis peptideEGF3 berlabel FITC dan mengesahkan bahawa, seperti Netrin penuh-1, ia dapat mengikat DCC pada membran plasma (Rajah 1F). Secara keseluruhan, data kami menunjukkan bahawa domain EGF3 bertanggungjawab untuk interaksi Netrin-1 dengan DCC.

2.2. Domain EGF3 Mendorong Fosforilasi Laluan Hilir Netrin-1

Interaksi Netrin-1 dan DCC mengaktifkan berbilang laluan isyarat, termasuk FAK, SFK dan ERK [16,35]. Kinase lekatan fokus (FAK) ialah salah satu aktiviti tyrosinephosphorylation utama yang dikaitkan dengan isyarat Netrin-1/DCC.

Netrin-1 mengaktifkan FAKphosphorylation dan Src family protein tyrosine kinase (SFKs) fosforilasi [17]. Kedua-dua laluan isyarat FAK dan SFK memainkan peranan penting dalam peringkat perkembangan sistem saraf dan pembaikan kecederaan [36,37]. Selain itu, Netrin-1 boleh mengaktifkan kinase terkawal isyarat ekstraselular-1/2 (ERK1/2), yang mengantara tindakan laluan proteinkinase diaktifkan Mitogen (MAPK) [38–40].

Untuk menyiasat sama ada domain EGF3 adalah kritikal untuk pengaktifan laluan isyarat hiliran melalui pengikatan Netrin-1 kepada DCC, kami mula-mula mengkaji kesan domain EGF3 pada fosforilasi tyrosine 861 FAK(Rajah 2A) . Kami mendapati bahawa pemadaman EGF3 menghalang fosforilasi FAK dalam neuron kortikal berbudaya (Rajah 2B, C), sekali gus mengesahkan peranan penting untuk EGF3 dalam laluan isyarat Netrin-1.

Seterusnya, neuron kortikal berbudaya telah dirangsang dengan protein GST-EGF3fusion selama 20 minit, dan western blotting mengesahkan lagi bahawa rawatan dengan protein gabungan GST-EGF3 mendorong fosforilasi FAK, ERK, dan SFK (Rajah 2D-G).

Keputusan ini menunjukkan bahawa domain EGF3 Netrin-1 berfungsi sebagai stimulator kuat untuk mengaktifkan laluan isyarat hiliran.

Rajah 1. Domain EGF3 Netrin-1 ialah rantau kritikal untuk interaksi Netrin-1/DCC. (A) Ilustrasi binaan-1Netrin. Binaan Netrin-1 ialah Netrin-1 penuh, Netrin-1-(∆407–443) dan GST-EGF3. (B) Netrin Dimurnikan-1-(∆407–443)-Myc/His dikira melalui perbandingan dengan lengkung piawai BSA. (C) Imunoblotting pecahan tarik-turun oleh protein gabungan domain GST-DCC FN5 dan GST sahaja. (D) Imej imunofluoresensi Flag-DCC yang menyatakan sel 293T yang diinkubasi dengan medium kawalan, Netrin-1-myc/his dan Netrin-1-(∆407–443) -Myc/his selama 30 minit, masing-masing, dan kuantitatif analisis. Bar skala, 10 µm. (E) Imunoblotting pecahan tarik-turun oleh protein gabungan GST-EGF3 dan GST bersama. (F) Imej imunofluoresensi Flag-DCC yang menyatakan sel 293T diinkubasi dengan medium kawalan dan FITC berlabel Pep EGF3 masing-masing selama 30 minit, dan analisis kuantitatif. Bar skala, 10 µm.

Rajah 2. Domain EGF3 mengaktifkan laluan hiliran Netrin-1. (A) Prosedur eksperimen. (B) Neuron kortikal (E17dan DIV3) telah dirangsang dengan Netrin-1, Netrin-1-(∆407–443) atau medium kawalan selama 20 min. Lisat sel diinkubasi dengan antibodi anti-p-FAK{12}} untuk mengesahkan aktiviti Netrin{13}}. (C) Analisis kuantitatif keputusan western blot ditunjukkan dalam (B). n=3. (D) Neuron kortikal (DIV3) telah dirawat dengan 1.5 µM GST (+), 1.5 µM protein gabungan GST-EGF3 (+), atau 1.5 µMNetrin-1 (+) selama 20 minit. Lisat sel diinkubasi dengan anti-p-FAK-861, anti-p-SFK-418 dan anti-p-ERK-202/204.(E–G) Analisis kuantitatif barat keputusan hapuskan ditunjukkan dalam (D). n=3. Data dibentangkan sebagai min ± SEM. ANOVA sehala digunakan untuk semua analisis statistik yang ditunjukkan dalam rajah ini (* p < 0.05, ** p < 0.01; ns, tidak signifikan). Butiran analisis data dilihat dalam Jadual Tambahan S1.

2.3peptida E1 dan E2 Berinteraksi dengan DCC untuk Mengaktifkan Laluan Isyarat Hilir Netrin-1

Seperti yang diterangkan sebelum ini, peptida kecil yang diperoleh daripada domain EGF3 Netrin-1(asid amino 423–433) mendorong fosforilasi ERK [27]. Kami mensintesis peptida E1 (sisa 407–422) dan E2 (sisa 423–433) yang diperoleh daripada domain EGF3 Netrin-1 (Rajah 3A).

Kami mendapati bahawa inkubasi peptida E1 meningkatkan tahap FAK dan SFK terfosforilasi (Rajah 3B, D, E) dalam sel kultur dalam cara yang bergantung kepada dos tetapi tidak mengubah tahap ERK terfosforilasi (Rajah 3B, F).

Tidak seperti peptideE1, peptida E2 bukan sahaja mendorong fosforilasi tirosin FAK (Rajah 3C, G) dan fosforilasi tirosin SFK (Rajah 3C, H) tetapi juga mendorong fosforilasi tirosin ERK (Rajah 3C, I) dalam neuron kortikal berbudaya.

Peptida kawalan (Pep Ctrl) tidak mempunyai kesan yang dapat dikesan pada fosforilasi tyrosine FAK, SFK, dan ERK (Rajah S1). Tambahan pula, kami mendapati bahawa fosforilasi komponen laluan isyarat FAK yang disebabkan oleh peptida E1 adalah bergantung kepada masa (Rajah S2). Keputusan ini menunjukkan bahawa E1 dan E2 ialah peptida berfungsi minimum Netrin-1.

Rajah 3. Jujukan minimum domain EGF3 mengaktifkan laluan hiliran Netrin-1. (A) Ilustrasi peptida. (B) Neuron kortikal (DIV3) telah dirangsang dengan kepekatan kecerunan peptida E1. Lisat sel telah diinkubasi dengan anti-p-FAK-861, anti-p-SFK-418 dan anti-p-ERK-202/204. (C) Neuron kortikal yang dikultur telah dirawat dengan kepekatan kecerunan peptida E2.

Lysates dikumpulkan dan diinkubasi dengan antibodi yang ditunjukkan untuk mengukur fosforilasi FAK, SFK, dan ERK. (D-F) Kuantifikasi tahap fosforilasi FAK, SFK, dan ERK yang disebabkan oleh peptida E1 dalam neuron ditunjukkan dalam (B). n=3. (G-I) Kuantifikasi tahap FAK, SFK, dan fosforilasi ERK yang disebabkan oleh peptida E2 ditunjukkan dalam (C). n=3. (J) Neuron kortikal yang diperoleh daripada mutantembrio jenis liar DCC dan homozigot telah dirangsang dengan peptida terbitan Netrin-1 atau Netrin-1-dan telah dilisekan.

Lisat yang terhasil tertakluk kepada immunoblotting. (K) Kuantifikasi tahap FAK PY{{0}} dan DCC dalam neuron mutan DCC ditunjukkan dalam (J). n=3. Data dibentangkan sebagai min ± SEM. ANOVA sehala digunakan untuk semua analisis statistik yang ditunjukkan dalam angka ini (* p <0.05; ns, tidak signifikan). Butiran analisis data dilihat dalam Jadual Tambahan S1.

Untuk menentukan sama ada pengaktifan laluan isyarat FAK bergantung kepada DCC, kami mengukur tahap fosforilasi tyrosine FAK yang disebabkan oleh peptida ini dalam neuron DCC +/+ dan DCC−/−. Kami mendapati bahawa kedua-dua peptida E1 dan E2 gagal untuk mendorong fosforilasi FAK dalam neuron DCC-/- (Rajah 3J, K).

Kami juga mendapati bahawa peptida bertanda Bendera E1 dan E2 yang disintesis secara N-terminal (Bendera-E1 dan Bendera-E2) secara langsung mengikat dengan domain DCCFN5 (Rajah S3).

2.4. Peptida E1 Melindungi Neuron daripada Kematian Sel Berpunca Hemin Secara In Vitro

Untuk mempamerkan perlindungan terhadap kecederaan neuron peptida E1, kami menggunakan tindak balas ketoksikan teraruh Hemin untuk meniru kecederaan otak sekunder selepas pendarahan intracerebral [41,42].

Sel neuron (NLT) yang mengekspresikan GnRH yang dikultur [43-45] diinkubasi dengan hemin pada kepekatan dan tempoh yang berbeza. Inkubasi sel NLT dengan hemin pada dos maut medial (60 µM) mengakibatkan penurunan bergantung masa dalam kadar survival sel, yang menunjukkan bahawa hemin telah diambil oleh neuron dan dimetabolismekan (Rajah S4).

Untuk memeriksa sama ada ungkapan Netrin-1 dan DCC bertindak balas terhadap kematian sel neuron yang disebabkan oleh hemin, sel NLT yang dikultur diinkubasi dengan hemin untuk tempoh yang berbeza. Keputusan western blot menunjukkan bahawa tahap ekspresi Netrin-1 dan DCC meningkat dengan ketara pada 6 jam selepas pengeraman hemin dan kemudiannya menurun secara beransur-ansur (Rajah 4A, B).

Untuk menyiasat sama ada peptida E1 dan E2 dapat melemahkan kematian neuron akibat hemin, kami melakukan ujian CCK-8 dengan Netrin-1, PepCtrl, peptida E1 dan peptida E2.

Kami mendapati bahawa peptida ini tidak mempunyai kesan yang dapat dikesan pada daya maju sel (Rajah 4C dan Rajah S5). Berbanding dengan pengeraman dengan Pep Ctrl dan peptideE2, peptida E1 dan Netrin-1 memulihkan kematian neuron yang disebabkan oleh hemin (Rajah 4D). Kami juga diwarnai dengan calcein-AM dan PI untuk membezakan sel hidup dan sel mati.

Keputusan menunjukkan bahawa kedua-dua Netrin-1 dan peptida E1 dilindungi daripada kematian akibat hemin secara in vitro (Rajah 4E–G). Tambahan pula, 1.5 µM peptida E1 mengurangkan kematian akibat hemin dalam neuron kultur primer (Rajah 4H, I). Secara keseluruhannya, keputusan ini menunjukkan bahawa peptida E1 melindungi neuron daripada kematian sel yang disebabkan oleh hemin.

2.5. Netrin-1-Derived Peptide E1 Menggalakkan Pemulihan Fungsian selepas ICH

Untuk menyiasat sama ada peptida E1 yang terhasil daripada Netrin-1 memainkan peranan penting dalam pemulihan tidak berfungsi selepas strok pendarahan, kami menubuhkan inmice model ICH percubaan dengan menyuntik kolagenase bercampur dakwat ke dalam striatum (Rajah S6A).

Selepas tiga hari, imej kepingan otak ditunjukkan untuk mengesan kedudukan suntikan dan volum kolagenase dengan dakwat (Rajah S6B, C). Tikus dengan pendarahan striatal menunjukkan kelemahan pada sisi ipsilateral kerana kecederaan otak (Rajah S7A-C).

Hematoma dalam striatum berikut ICH kelihatan berbanding dengan suntikan garam (Rajah S7D). Tahap protein therelatif Netrin-1 dan DCC dalam korteks perihematomal telah meningkat dalam tikus ICH berbanding tikus kawalan pada hari ke-2 dan Netrin-1 masih lebih tinggi dengan ketara pada hari ke-3, menunjukkan bahawa Netrin-1 adalah penting untuk pemulihan kecederaan otak (Rajah S7E, F).

Seterusnya, TAT-peptida E1 berlabel FITC (FITC-Pep TE1), yang menambah urutan TAT dari terminal N peptida E1, telah disuntik ke dalam tikus ICH dan FITC-Pep TE1 telah ditunjukkan untuk menyeberangi penghalang darah-otak ( Rajah S8).

ICH dan tikus kawalan disuntik secara intraperitoneal dengan peptida (12 mg/kg) setiap hari atau jumlah garam yang sama (Rajah 5A). Kami mendapati bahawa pentadbiran dengan peptida TE1 meningkatkan kadar survival dan menyelamatkan kecacatan dalam berat badan selepas ICH (Rajah 5B, C).

Kami juga mendapati volum kolagenase yang dikesan dengan nisbah dakwat yang sama dalam setiap kumpulan adalah serupa, mengesahkan model kolagenase standardICH ini menghasilkan hematoma intrastriatal yang boleh dihasilkan semula (Rajah 5D). Peptida TE1 meningkatkan skor tingkah laku tikus ICH dalam ujian penyingkiran pita (Rajah 5E). ) dan ujian silinder (Rajah 5F).

Seperti yang dijangkakan, peptida TE1 mengurangkan jumlah infark selepas ICH (Rajah 5G, H). Diambil bersama, keputusan ini menunjukkan bahawa peptida E1 boleh mengurangkan jumlah hematoma dan meningkatkan pemulihan fungsi dalam model tetikus ICH.

Rajah 4. Peptida E1 memperbaiki kematian sel akibat hemin secara in vitro. (A) Western blot Netrin-1 dan DCC dalam sel NLT kultur yang terdedah kepada Hemin (60 µM). (B) Analisis kuantitatif bagi blotresult barat ditunjukkan dalam (A). n=3. (C) Ujian CCK-8 menunjukkan bahawa siri peptida tidak mengubah daya hidup sel. n=4. (D) 1.5 µM Pep E1 mengekalkan daya maju sel NLT apabila ditambah dengan baik selepas pendedahan kepada hemin (60 µM). n=4. (E) Ujian hidup (hijau)/Mati (merah) sel NLT yang terdedah kepada hemin (60 µM,6 jam). Bar skala, 50 µm. (F, G) Analisis kuantitatif ujian hidup/mati dalam (E). n=9. Ujian (H) CCK-8menunjukkan bahawa Pep E1 boleh mengurangkan kematian sel akibat hemin dalam neuron kultur primer. n=8.(I) Pengimejan ujian hidup/mati bagi neuron kultur primer (50 µM, 6 jam). Bar skala, 50 µm. Data ditunjukkan sebagai min ± SEM. ANOVA sehala atau ANOVA Dua hala digunakan untuk semua analisis statistik yang ditunjukkan dalam rajah ini (* p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001; ns, tidak signifikan). Butiran analisis data dilihat dalam Jadual Tambahan S1.

Rajah 5. Netrin-1-peptida E1 yang diperolehi menggalakkan proses pemulihan selepas ICH. (A) Skema suntikan paradigmof intraperitoneal (IP) eksperimen peptida TE1 dalam pemodelan ICH tikus. (B) Nisbah kelangsungan hidup selepas ICH setiap kumpulan telah direkodkan, dan kaedah Kaplan-Meier digunakan. n=10. (C) Berat badan berubah pada 5 hari selepas ICH. n=6.(D) Campuran kolaj/Masin dengan nisbah dakwat yang sama (jumlah 0.6 µL) yang disuntik dalam striatum tikus C57, imej perwakilan yang menunjukkan kawasan yang serupa pada tikus yang dirawat dengan/ tanpa peptida TE1 5 hari selepas ICH. (E, F) Suntikan IP peptida TE1 (12 mg/kg) tetapi bukan kawalan TAT (12 mg/kg), tingkah laku yang lebih baik seperti yang dipantau oleh tugas penyingkiran pita (E) atau tugas sudut (F).

Saline,n=10 haiwan individu; ICH, n=6 haiwan individu; ICH + TAT, n=6 haiwan individu; ICH + TE1, n=8 haiwan individu. (G) Perwakilan hematoxylin dan bahagian bernoda eosin pada tikus yang dirawat dengan/tanpa peptida TE1 5 hari selepas ICH. Bar skala, 1 mm. (H) Kuantiti isipadu pendarahan dalam bahagian otak ditunjukkan dalam (G).

Saline, n {{0}} haiwan individu; ICH, n=6 haiwan individu; ICH + TAT, n=6 haiwan individu; ICH + TE1, n=8 haiwan individu. Data ditunjukkan sebagai min ± SEM. ANOVA sehala atau ANOVA Dua hala telah digunakan untuk semua analisis statistik yang ditunjukkan dalam rajah ini (* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001; ns, tidak ketara). Butiran analisis data dilihat dalam Jadual Tambahan S1.

2.6. Netrin-1-Penerbitan Peptida E1 Mengurangkan Apoptosis Neuron selepas ICH

Untuk meneroka mekanisme asas peptida E1 dalam proses pemulihan fungsi ICH. Kami mengesan degenerasi neuron di kawasan perihematomal oleh pewarnaan fluoro-jade C (FJC).

Kami mendapati bahawa pentadbiran peptida TE1 dengan ketara mengurangkan bilangan sel FJC-positif di kawasan perihematoma, menunjukkan bahawa pep TE1 menghalang degenerasi neuron selepas ICH (Rajah 6A, B). Kami melakukan pewarnaan TUNEL dan mendapati bahawa peptida TE1 dengan ketara mengurangkan bilangan neuron TUNEL-positif (Rajah 6C, D).

Bilangan astrocytes TUNEL-positif tidak dapat dikesan perubahan selepas rawatan TE1 (Rajah 6E, F). Di samping itu, dengan menggunakan dextran 4 kDa berlabel FITC sebagai penjejak untuk menunjukkan kebolehtelapan penghalang darah-otak (BBB), kami mendapati bahawa peptida TE1 tidak menjejaskan pemulihan kebolehtelapan BBB (Rajah S9A, B).

Tahap unit pendarfluor mentah (RFU) serum adalah serupa, mengesahkan kehadiran pengesan yang disuntik dalam semua haiwan yang dianalisis (Rajah S9C). Kami juga menggunakan lektin berlabel fluorescein untuk melabelkan kapal mikro tetapi gagal untuk melihat sebarang peningkatan selepas rawatan TE1 (Rajah S9D, E). Di atas semua, penemuan ini mencadangkan bahawa peptida E1 menggalakkan pemulihan neuron selepas ICH dengan menghalang apoptosis neuron.

Rajah 6. Peptida E1 terbitan Netrin-1-boleh melindungi daripada kematian dan degenerasi neuron, tetapi bukan astrosit selepas ICH.(A) Wakil bahagian yang diwarnai C Fluoro-jed pada tikus yang dirawat dengan/tanpa TE1 pada 5 hari selepas ICH. Bar skala, 50 µm, dan 10 µm, masing-masing. (B) Kuantiti sel positif Fluoro-jed C dalam kawasan perihematom (n=4). (C) TUNELstaining menunjukkan kesan TE1 pada kecederaan otak sekunder (SBI) pada 5 hari selepas permulaan ICH. Imej perwakilan daripada kumpulan Saline, ICH, ICH + TAT dan ICH + TE1.

Setiap kumpulan telah dikenakan ICH kecuali kumpulan Saline. Bar skala, 50 µm, dan 10 µm masing-masing. (D) Analisis kuantitatif untuk peratusan neuron TUNEL-positif ditunjukkan dalam (C). n=4. (E) Kolokalisasi TUNEL dengan GFAP pada 5 hari selepas ICH. Imej perwakilan daripada kumpulan Saline, ICH, ICH + TAT dan ICH + TE1. Bar skala, 50 µm, dan 10 µm, masing-masing. (F) Analisis kuantitatif untuk peratusan astrosit TUNEL-positif ditunjukkan dalam (E). n=4. Data dibentangkan sebagai min ± SEM.

ANOVA sehala telah digunakan untuk semua analisis statistik yang ditunjukkan dalam rajah ini (* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001; Butiran analisis data dilihat dalam Jadual Tambahan S1.

3. Perbincangan

Kajian kami mengenal pasti jujukan peptida teras Netrin-1 yang penting untuk pemulihan fungsi selepas ICH. Dengan berinteraksi dengan DCC, peptida terhasil Netrin-1-ini melindungi daripada kematian neuron akibat kerosakan sekunder selepas ICH dan dengan itu merupakan rawatan yang menjanjikan untuk ICH.

Aplikasi terapeutik Netrin-1, protein dengan berat molekul tinggi, memerlukan pengenalpastian jujukan fungsi minimum Netrin-1 yang menggalakkan isyarat hiliran. Dalam kajian kami, peptida E1 (sisa 407–422) dan E2 (sisa 423–433), yang masing-masing diperoleh daripada domain EGF3 Netrin-1, telah dijana. Kami mendapati bahawa peptida E1 (sisa 407-422) dilindungi daripada kematian neuron selepas ICH.

Kami mendapati bahawa tahap ekspresi Netrin-1 dan DCC telah meningkat dalam sel NLT selepas rawatan hemin. Hemin dibebaskan daripada hemoglobin selepas ICH dan menyebabkan kecederaan sekunder kepada kedua-dua sel glia dan neuron [46-48].

Selain itu, kami juga memerhatikan peningkatan tahap protein Netrin-1 dan DCC berikutan ICH percubaan. Selain itu, kami juga memerhatikan peningkatan paras protein netrin-1 dan DCC berikutan ICH percubaan.

Keputusan ini konsisten dengan keputusan sebelumnya yang menunjukkan bahawa netrin-1 memainkan peranan penting dalam pemulihan selepas ICH [49].

For more information:1950477648nn@gmail.com