Kajian Perbandingan Sifat Dan Mekanisme Anti-penuaan: Resveratrol Dan Sekatan Kalori Ⅱ
May 15, 2023
Kesan resveratrol dan CR pada ekspresi mRNA SIRT1, p53, dan Foxo3a dalam tisu tikus penuaan
Keadaan tekanan oksidatifsering mendorong ekspresi dan aktiviti SIRT1. SIRT1 memodulasi fungsi faktor survival utama termasuk p53 dan Foxo3a [9]. Untuk menentukan kesan resveratrol dan CR pada tahap mRNA SIRT1, p53, dan Foxo3a dalam tikus penuaan yang disebabkan oleh D-Gal, ujian RT-PCR kuantitatif dilakukan. Berbanding dengan kumpulan kawalan negatif yang sepadan, tahap ekspresi mRNA SIRT1 dan Foxo3a telah menurun dengan ketara, tetapi tahap p53 meningkat dengan ketara dalam kumpulan D-Gal (P < 0.01; Rajah 9A dan 9B). Tambahan pula, rawatan serentak resveratrol atau CR dengan D-gal pada tikus menyebabkan peningkatan dalam tahap ekspresi mRNA SIRT1 dan Foxo3a tetapi menurunkan tahap p53 berbanding dengan kumpulan kawalan model (P < 0.05). Walau bagaimanapun, berbanding dengan rawatan CR, tahap ekspresi mRNA SIRT1 telah meningkat dengan ketara dalam hati dengan dos tinggi resveratrol ditambah kumpulan D-gal, tahap ekspresi mRNA p53 telah menurun dengan ketara dalam hati dan otak dengan dos tinggi resveratrol ditambah D- kumpulan gal (P <0.05).
Klik Di Sini Untuk Mendapatkan Suplemen Anti-Penuaan Cistanche
Kesan resveratrol dan CR pada ekspresi protein utama SIRT1-terkait dalam tisu otak tikus yang semakin tua
FOXO3a dan p53, yang dikawal oleh SIRT1, adalah molekul hiliran SIRT1. Pada masa yang sama, aktiviti SIRT1 dikawal oleh molekul huluannya, contohnya, DBC1 (juga dikenali sebagai KIAA1967), AROS (juga dikenali sebagai RPS19BP1) dan penekan tumor HuR (juga dikenali sebagai ELAVL1) [9, 10] . Untuk menentukan kesan resveratrol dan CR pada tahap protein p53, FOXO3a, HuR, AROS, dan DBC1 dalam tikus penuaan yang disebabkan oleh D-Gal, ujian western blot telah dilakukan. Berbanding dengan kumpulan kawalan negatif yang sepadan, tahap ekspresi protein FOXO3a, AROS dan HuR telah menurun dengan ketara, tetapi tahap p53 dan DBC1 meningkat dengan ketara dalam kumpulan D-gal (P < 0.01 ; Rajah 10). Tambahan pula, rawatan serentak resveratrol atau CR dengan D-gal pada tikus menyebabkan peningkatan dalam ekspresi protein FOXO3a, AROS dan HuR tetapi menurunkan tahap p53 dan DBC1 berbanding dengan kumpulan kawalan model (P <0.05). Walau bagaimanapun, berbanding dengan rawatan CR, tahap ekspresi protein HuR meningkat dengan ketara tetapi tahap DBC1 menurun dengan ketara dalam otak dengan dos tinggi resveratrol ditambah kumpulan D-gal (P <0.05). Tiada perbezaan antara kumpulan resveratrol ditambah D-gal dan kumpulan CR ditambah D-gal dalam tahap p53, FOXO3a dan ekspresi protein AROS (P > 0.05).
Ekspresi FOXO3a dan p53 dalam tisu otak dan hati
Status ekspresi FOXO3a dan p53 ditentukan dalam tisu otak dan hati oleh imunohistokimia. Analisis imunohistokimia FOXO3a dan p53 mendedahkan bahawa ekspresi FOXO3a dalam tisu otak dan hati telah berkurangan dengan ketara, dan ekspresi p53 meningkat dengan ketara dalam kumpulan D-Gal, berbanding dengan kumpulan kawalan negatif (P < 0.{{13} }5, Rajah 11). Selain itu, rawatan serentak resveratrol atau CR dengan D-gal pada tikus menyebabkan peningkatan dalam ekspresi FOXO3a tetapi menurunkan ekspresi p53 berbanding dengan kumpulan kawalan model (P < 0.05). Walau bagaimanapun, tiada perbezaan antara kumpulan resveratrol ditambah D-gal dan kumpulan CR ditambah D-gal dalam ekspresi p53 dan FOXO3a (P > 0.05).
PERBINCANGAN
Proses kimia asas yang mendasari penuaan mula-mula dimajukan olehteori penuaan radikal bebas[11],dantekanan oksidatifdipercayai sebagai faktor utama dalam proses penuaan normal.Inisiator radikal bebas AAPHtelah digunakan untukmendorong tekanan oksidatifdan mewujudkan model oksidatifpenuaan selular yang disebabkan oleh tekanandalam sel IMR-90 manusia [12, 13]. Kelebihan kaedah ini ialah AAPH terurai secara terma kepadamenghasilkan radikaltanpa biotransformasi atau enzim, dan kadargenerasi radikalboleh dikawal dengan mudah dengan melaraskan kepekatan pemula [12]. AAPH didapatimenghalang pembiakan manusiasel IMR- 90 dalam kepekatan dan cara bergantung pada masa. Keputusan menunjukkan bahawa pengeraman 2 hari dengan AAPH (1 mM) dengan ketara meningkatkan peratusan nisbah positif SA -Gal, populasi sel apoptosis, mengurangkan ekspresi mRNA SIRT1, dan mendorong morfologi yang diperbesar dan diratakan. Ini menunjukkan bahawa tekanan oksidatif yang terhasil oleh AAPH membawa sel IMR-90 kepada penuaan. Berdasarkan model penuaan selular ini, rawatan resveratrol 10 μM dengan lebih cekap menghalang penuaan dan apoptosis yang disebabkan oleh AAPH daripada rawatan CR.
Model haiwan D-gal ialah model haiwan penuaan yang diiktiraf di peringkat antarabangsa dan telah digunakan secara meluas dalam bidangubat anti penuaan. D-gal ialah nutrien fisiologi yang biasanya dimetabolismekan oleh D-galaktokinase dan galaktosa-1-fosfat dalam haiwan. Walau bagaimanapun, lebihan bekalan D-gal, yang tidak dimetabolismekan oleh enzim di atas tetapi terkumpul di dalam sel, membawa kepada tekanan oksidatif dan kerosakan selular [14]. Oleh itu, pentadbiran D-gal jangka panjang mendorong perubahan yang menyerupai penuaan semula jadi pada haiwan, seperti jangka hayat yang dipendekkan, disfungsi kognitif, degenerasi neuro, tekanan oksidatif, penurunan tindak balas imun, dan pembentukan produk akhir glikasi lanjutan (AGE) [15]. Kajian ini menunjukkan kejayaan penubuhan model penuaan mimetik, yang dibuktikan oleh pembelajaran yang luar biasa dan kemerosotan ingatan, pengeluaran MDA, pengumpulan lipofuscin, penurunan T-AOC dan SOD, dan pengawalan menurun aktiviti telomerase dalam otak. Sementara itu, rawatan resveratrol atau CR melindungi tikus yang disebabkan oleh D-gal daripada tekanan oksidatif dengan meningkatkan aktiviti enzim antioksidan, mengurangkan tahap produk peroksidasi lipid, dan mengekalkan keseimbangan sistem oksidatif dan antioksida. Dalam ujian aktiviti tingkah laku dan telomerase, rawatan resveratrol atau CR boleh membalikkan gangguan kognitif yang disebabkan oleh D-gal dan aktiviti telomerase. Lebih-lebih lagi, tikus model penuaan yang dirawat dengan dos resveratrol yang tinggi menunjukkan kesan yang agak ketara terhadap tingkah laku daripada yang dirawat dengan CR.
Rajah 11: Analisis imunohistokimia bagi ekspresi p53 (A, B) dan FOXO3a (C, D) dalam tisu hati (A, C) dan otak (B, D) tikus yang semakin tua. Pembesaran ialah 20×. NG, kumpulan kawalan negatif; MG, kumpulan kawalan model; RESL, dos rendah kumpulan resveratrol; RESH, kumpulan resveratrol dos tinggi; CR, kumpulan sekatan kalori
Kajian telah menunjukkan bahawa CR, pengurangan 10-40 peratus dalam pengambilan diet berkhasiat, bolehmelambatkan penuaan dan meningkatkan jangka hayat, oleh itu satu tahap CR yang biasa digunakan (pengurangan 40 peratus dalam pengambilan makanan) telah digunakan dalam tikus kumpulan CR dalam kajian ini. Walau bagaimanapun, beberapa penyiasatan mendedahkan bahawa tiada kesan berfaedah CR pada umur panjang dalam primata yang berumur secara semula jadi [16]. Begitu juga, walaupun rawatan resveratrol ditunjukkan untuk mendorong kesan seperti CR padametabolisme tenagadan profil metabolik pada manusia obes [17], ia tidak meningkatkan fungsi metabolik pada wanita bukan obes dengan toleransi glukosa normal [18]. Sebab perbezaan antara kajian ini tidak jelas tetapi mungkin CR dan resveratrol berfungsi untuk memulihkan homeostasis dalam individu yang terjejas secara metabolik, dan kurang pada individu yang sihat, kemungkinan yang konsisten dengan fungsi SIRT1 yang diketahui dalam kajian haiwan [19]. Oleh itu, model tikus penuaan yang disebabkan oleh D-gal telah digunakan untuk membandingkan aktiviti anti-penuaan resveratrol atau CR , dan bukannya model tikus berusia semula jadi.
SIRT1, deacetylase yang bergantung kepada (NAD plus), telah mendapat banyak perhatian kerana pelbagai peranannya dalam lanjutan jangka hayat, rintangan tekanan dan pengurangan apoptosis [20, 21]. Kajian terkumpul telah menunjukkan bahawa SIRT1 adalah sasaran utama resveratrol dan CR [22]. Terdapat sejumlah besar molekul hiliran SIRT1, termasuk p53, Foxo1, Foxo3, Foxo4 dan E2F1, yang dikawal oleh SIRT1. Pada masa yang sama, aktiviti SIRT1 dikawal oleh molekul huluannya, contohnya, p53, HIC1, E2F1, DBC1, HuR dan AROS. Pengeluaran nutrien akut mengaktifkan program transkrip di promoter SIRT1 yang diarahkan oleh faktor transkripsi Foxo3a dan p53. Oleh kerana p53 menindas ekspresi gen SIRT1, penyingkirannya oleh Foxo3a mengaktifkan transkripsi SIRT1 [23]. DBC1 dan AROS baru-baru ini digambarkan sebagai pengawal selia negatif dan positif langsung aktiviti SIRT1, masing-masing, HuR menunjukkan kesan mengurangkan tahap ekspresi SIRT1 dalam sel senescent yang berumur [9, 10].
CRmelambatkan penuaan dan memanjangkan jangka hayat median dan maksimumdalam pelbagai spesies, termasuk tikus, tikus, ikan, lalat, cacing dan yis. Walau bagaimanapun, program pemakanan yang ketat sedemikian dalam orang yang hidup bebas telah menimbulkan isu etika dan metodologi [24]. Pada masa ini, meningkatkan jangka hayat mungkin lebih penting daripada sekadar memanjangkan jangka hayat. Penyiasatan terkini mencadangkan bahawa resveratrol adalah salah satu penghasut aktiviti SIR2 yang paling kuat di kalangan semua polifenol tumbuhan [25], dan ia mempengaruhi umur panjang melalui mekanisme yang sama seperti yang dilihat dalam sekatan kalori. Keputusan ini menunjukkan bahawa CR dan resveratrol mempunyai aktiviti yang sama untuk memulihkan tahap ekspresi mRNA SIRT1, meningkatkan ekspresi protein FOXO3a, AROS dan HuR dan menurunkan tahap p53 dan DBC1. Sementara itu, beberapa baris bukti yang meyakinkan menunjukkan kesan berfaedah resveratrol pada sistem saraf, hepatik dan kardiovaskular.
BAHAN DAN KAEDAH
Kultur sel, tekanan dan rawatan
Strain fibroblas diploid manusia IMR-90 diperoleh daripada ATCC. Sel telah ditanam dalam medium penting minimum (MEM) (Gibco, UK) ditambah dengan 10 peratus serum lembu janin (FBS) (Gibco) pada 37 darjah dalam 5 peratus CO2 . Selepas pertemuan telah dicapai, sel-sel telah disemai ke dalam 6-plat kultur telaga. Satu hari kemudian, sel telah dirawat selama 48 jam dengan 1 mM 2,2′-azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) (Sigma, USA) dicairkan dalam MEM ditambah 10 peratus FBS. Inkubasi 48 jam dengan pemula radikal bebas AAPH mewujudkan model penuaan selular yang disebabkan oleh tekanan oksidatif [12, 13]. Sel kawalan diinkubasi dalam medium kultur sahaja. Selepas rawatan AAPH, IMR-90 dibasuh dengan garam penimbal fosfat sejuk (PBS) pH 7.4 dan diinkubasi dengan medium kultur segar atau medium kultur yang mengandungi resveratrol (kumpulan resveratrol) atau MEM ditambah dengan 3 peratus FBS (kumpulan CR) untuk tambahan 48 jam sebelum menuai.
Aktiviti pewarnaan SA -gal
Kemunculan biomarker penuaan telah diperiksa (penurunan potensi proliferatif dan peningkatan dalam pewarnaan SA -gal) [26] dari hari selepas rawatan. Kemudian sel-sel telah diwarnakan mengikut arahan pengeluar Kit Pewarnaan SA -gal (CST, USA). Selepas pewarnaan, sekurang-kurangnya 300 sel dalam beberapa bidang telah diperiksa dan sel positif SA -gal dikira. Eksperimen ini diulang tiga kali, dan hasilnya dibentangkan sebagai nilai min dengan sisihan piawai (SD). Untuk mengelakkan pewarnaan tidak spesifik yang mungkin disebabkan oleh pertemuan sel, pewarnaan histokimia SA -gal dilakukan dengan sel subkonfluen.
Mengimbas analisis mikroskop elektron
Sel-sel telah ditanam pada coverlips dalam 6-plat kultur perigi seperti yang diterangkan di atas. Selepas resveratrol dan CR dirawat, slip penutup dikeluarkan dari plat, kemudian sel-sel difiksasi dalam 2.5 peratus glutaraldehid penampan fosfat dan difiksasi selepas 1 peratus osmium tetroksida penimbal. Spesimen tetap telah direndam dalam t-butil alkohol selepas dehidrasi melalui siri etanol berperingkat. Spesimen telah dikeringkan secara beku daripada alkohol t-butil, kemudian disalut dengan emas menggunakan penyalut halus automatik (JFC-1600, JEOC, Jepun) dan diperiksa menggunakan mikroskop elektron pengimbasan (JEOL, JSM{{11} }LV, Jepun).
Analisis apoptosis
Selepas pengeraman resveratrol atau CR, semua sel dituai dengan trypsin dan dibasuh dua kali dengan PBS, diikuti dengan digantung semula dalam penampan pengikat Annexin V 400 μL. Kemudian sel-sel itu diwarnai mengikut arahan pengeluar kit pengesanan apoptosis sel Annexin V-FITC (BestBio, China). Sitometer aliran FACSCalibur (Becton-Dickinson, San Jose, CA) digunakan untuk mengesan pendarfluor, dan peratusan sel apoptosis dikira oleh sistem perisian dalaman FACSCalibur. Kira-kira 104 sel telah dianalisis untuk setiap jejak.
Prosedur haiwan
Tikus albino Wistar jantan, seberat kira-kira 200 ± 10 g, diperoleh daripada Pusat Haiwan Eksperimen Kolej Perubatan Tongji, Universiti Sains dan Teknologi Huazhong (SCXK 2010-0009). Haiwan tersebut telah disesuaikan selama 2 minggu sebelum diberi dos di Pusat Haiwan Eksperimen Universiti Perubatan Cina Hubei, pada masa itu mereka mempunyai akses percuma kepada makanan dan air secara ad libitum. Selepas penyesuaian, 50 ekor tikus telah dipilih dan dibahagikan kepada lima kumpulan sepuluh setiap satu. Haiwan dikekalkan mengikut garis panduan dan protokol kebangsaan yang diluluskan oleh Jawatankuasa Etika Haiwan Institusi (IAEC).
Tikus Kumpulan I (Kumpulan kawalan negatif) menerima kenderaan sahaja (1 mL/kg berat badan 0.9 peratus garam) selama 6 minggu. Tikus Kumpulan II (Kumpulan kawalan model) menerima D-gal (200 mg/kg berat badan, Sigma Chemical, St. Louis, MO) selama 6 minggu. Tikus Kumpulan III (Dos rendah kumpulan resveratrol) menerima D-gal dan resveratrol (50 mg/kg berat badan) dilarutkan dalam 5 peratus dimetil sulfoksida (DMSO) selama 6 minggu. Tikus Kumpulan IV (Dos tinggi kumpulan resveratrol) menerima D-gal dan resveratrol (100 mg/kg berat badan). Tikus Kumpulan V (kumpulan CR) menerima D-gal dan CR (memakan diet yang 40 peratus lebih rendah kalori daripada tikus yang diberi makan secara ad libitum [27]) selama 6 minggu. D-gal diberikan secara intraperitoneal, manakala resveratrol diberikan secara lisan untuk keseluruhan tempoh eksperimen. Tikus telah dikorbankan pada hari terakhir rawatan, kemudian darah, sera dan organ segera dikumpulkan untuk bioassay atau disimpan pada −80 darjah untuk kegunaan kemudian.
Ujian tingkah laku
Ujian maze air Morris direka untuk menilai kapasiti pembelajaran spatial dan ingatan tikus selepas 6 minggu selepas kecederaan [28]. Ujian maze air Morris terdiri daripada 4-latihan pembelajaran dan ingatan hari serta percubaan siasatan pada hari ke-5. Haiwan dilatih dalam kolam bulat (diameter 155 cm) dengan isyarat visual. Platform melarikan diri (9.0 cm diameter) telah ditenggelami 1.0 cm di bawah permukaan air kolam, yang dikekalkan pada 25 ± 2 darjah . Lokasi platform kekal di tengah kuadran barat laut sepanjang 4-tempoh latihan hari. Pada setiap hari, tikus dilatih untuk satu blok pagi dan satu blok petang. Tikus itu berenang bebas sehingga menjumpai pelantar dalam masa 120s. Jika gagal, ia diletakkan di atas platform selama 10 saat. Latensi melarikan diri (mencari platform melarikan diri yang tenggelam) dan kelajuan berenang telah direkodkan. Perbicaraan siasatan dibuat dengan mengalihkan pelantar dan membenarkan setiap tikus berenang bebas selama 120 saat di dalam kolam. Bilangan lintasan platform dalam kuadran terlatih (di mana platform telah dikeluarkan) telah direkodkan dengan sistem video berkomputer. Versi platform air maze yang boleh dilihat tidak dilakukan selepas perbezaan ketara dalam kelajuan berenang diperhatikan antara tikus yang dirawat dengan D-gal dan kenderaan.
Pengesanan penunjuk biologi berkaitan tekanan oksidatif
Tahap MDA, SOD, dan T-AOC dalam darah dan tisu ditentukan secara fotometrik mengikut protokol pengilang dengan menggunakan kit ujian enzimatik yang tersedia secara komersil (Institut Bioengineering Nanjing Jiancheng, Bandar Nanjing, PR China). Semua eksperimen yang diterangkan dalam bahagian ini telah dilakukan dalam tiga kali ganda untuk mendapatkan min dan SD.
Tahap lipofuscin ditentukan oleh kaedah Sohal [29]. Secara ringkasnya, kami menimbang 200 mg korteks serebrum, menambah 2 ml ekstrak kloroform-methanol (2:1), dihomogenkan dan ditapis, kemudian mencuci sisa dengan ekstrak, menggabungkan turasan, menambah ekstrak kepada 5 ml dan mengukur keamatan pendarfluor pada spektrometer pendarfluor. Panjang gelombang pelepasan ialah 435 nm dan panjang gelombang pengujaan ialah 365 nm. Spektrofluorometer telah diseragamkan untuk memberikan pesongan 50 pada panjang gelombang di atas dengan larutan 1 ug/ml kina bisulfat dalam 0.1 M H2 SO4 . Keputusan dinyatakan sebagai unit pendarfluor relatif/ml kloroform/g berat tisu basah.
Pengesanan aktiviti TE
Untuk pengekstrakan telomerase kira-kira 3{3}} mg tisu dibasuh dua kali dalam PBS sejuk ais, dan akhirnya dihomogenkan dalam kira-kira 150 ml PBS. Aktiviti TE diukur menggunakan kit TE ELISA mengikut arahan pengilang (Nanjing Sen Beijia Biological Technology Co., Ltd., Nanjing, China). Had sensitiviti ujian adalah 0.8 IU/L untuk TE.
Analisis RT-PCR
Tahap ekspresi mRNA SIRT1, Foxo3 dan p53 dalam tisu hati dan otak dianalisis menggunakan analisis RT PCR. Jumlah RNA telah diekstrak menggunakan Trizol, dan kuantiti dan ketulenannya dinilai oleh mikrospektrofotometer ultra (Thermo Fisher Scientific, USA) berdasarkan ukuran penyerapan pada 260 dan 280 nm. Selepas kuantifikasi, cDNA telah disintesis menggunakan kit FastQuant RT (Tiangen Biotech, Beijing, China) mengikut arahan pengilang. Tahap ekspresi mRNA SIRT1, Foxo3, p53 diukur oleh RT-PCR menggunakan TIANGEN SuperReal PreMix Plus (Tiangen Biotech, Beijing, China) dengan primer tertentu (Jadual 2). PCR masa nyata kuantitatif dilakukan dengan sistem PCR LightCycler 480 darjah (Roche, Basel, Switzerland) menggunakan 20 μL sebagai jumlah isipadu setiap tindak balas. Penguatan PCR dimulakan dengan 15 minit denaturasi pada 95 darjah, dan kemudian diikuti dengan 40 kitaran 95 darjah selama 10 s, 59-63 darjah (suhu penyepuhlindapan) selama 20 s dan 72 darjah selama 30 s, dan pengeraman akhir pada 72 ijazah selama 5 min. Nombor ambang kitaran yang diperolehi bagi setiap gen (nilai Ct) telah dinormalisasi menjadi lipatan perubahan relatif mengikut persamaan kaedah 2-∆∆CT [30].
Jadual 2: Senarai primer
Analisis Western blot
Tahap ekspresi protein p53, FOXO3a, HuR, RPS19BP1, dan DBC1 dalam tisu otak dianalisis menggunakan analisis blotting barat. Jumlah protein tisu otak telah diekstrak menggunakan Penampan Lysis RIPA (Beyotime, China) mengikut arahan pengilang. Kepekatan protein ditentukan menggunakan Kit Assay Protein BCA (Beyotime, China). 5 mg protein diasingkan menggunakan 12 peratus gel SDS-polyacrylamide dan dipindahkan ke membran PVDF (0.45 μm, Millipore, Amerika Syarikat). Tompokan telah disekat dengan 5 peratus susu tanpa lemak dalam TBS, kemudian diinkubasi semalaman pada 4 darjah dengan pencairan antibodi primer yang sesuai: anti-p53 (SC- 6243, Santa Cruz Biotechnology), anti-FOXO3a (#12829, Sel Teknologi Isyarat), anti-HuR (#12582, Teknologi Isyarat Sel), anti-AROS (Ab201091, abcam), anti-DBC1 (#5857, Teknologi Isyarat Sel), anti- - tindakan (AC004, Teknologi ABclonal) . Selepas membasuh membran untuk mengeluarkan antibodi primer yang berlebihan, membran diinkubasi selama 1 jam pada suhu bilik dengan antibodi sekunder yang sesuai pada pencairan 1:2000-1:5000 (AC004 atau AS003, Teknologi ABclonal). Membran dicuci 3 kali dan kemudian divisualisasikan menggunakan Pierce ECL Western Blotting Substrate (Thermo Scientific). -tindakan digunakan sebagai kawalan dalaman.
Imunohistokimia
Sampel tisu telah ditetapkan dalam 10 peratus formalin penampan neutral dalam masa 1 jam selepas penyingkiran pembedahan dan dibenamkan parafin menggunakan prosedur standard. Kemudian spesimen yang dibenamkan parafin tetap dipotong kepada bahagian setebal 5-μm, yang dinyahparafin dalam xilena, dihidratkan semula dalam etanol dan dirawat gelombang mikro untuk mendapatkan semula antigen. Antibodi primer yang dicairkan dengan betul, anti-p53 (SC-6243, Bioteknologi Santa Cruz) dan anti-FOXO3a (#12829, Teknologi Isyarat Sel), telah diinkubasi selama 60 minit pada suhu bilik dalam ruang kelembapan. Slaid kemudiannya dibilas dalam PBS dan seterusnya diinkubasi dengan antibodi sekunder terhadap antibodi anti-arnab dan visualisasi HRP (kepekatan 1:300, #074-1506, KPL). Kemudian slaid dicuci dan bahagian telah dibangunkan dalam larutan enzim-substrat diaminobenzidine (DAB, Sigma). Imej bahagian yang diwarnakan secara imunohistokimia telah ditangkap oleh mikroskop digital Olympus (IX-73P1F, Olympus, Jepun).
Analisis statistik
Keputusan dinyatakan sebagai min ± SD untuk sekurang-kurangnya tiga percubaan bebas dan dianalisis menggunakan perisian SPSS 18.0. Perbezaan kumpulan dalam kependaman melarikan diri dan kelajuan berenang dalam tugas latihan maze air Morris dianalisis menggunakan analisis varians dua hala (ANOVA) dengan langkah berulang, faktornya ialah hari rawatan dan latihan. Data lain dianalisis dengan ANOVA sehala diikuti dengan ujian Tukey post-hoc. Nilai P kurang daripada 0.05 dianggap penting.
KESIMPULAN
Resveratrol dan CR mempamerkan aktiviti anti-penuaan yang serupa dalam kedua-dua in vitro dan in vivo, dibuktikan dengan keupayaan mereka untuk menghalang penuaan dan apoptosis yang disebabkan oleh AAPH, dan memulihkan kerosakan kognitif berkaitan usia yang disebabkan oleh pentadbiran D-gal. Mekanisme anti-penuaan mereka termasuk mengawal selia aktiviti TE, mengurangkan kerosakan oksidatif, dan mengawal laluan SIRT1. Secara keseluruhan, 10 μM resveratrol in vitro dan dos tinggi resveratrol in vivo mempamerkan aktiviti anti-penuaan dan merangsang tahap SIRT1 yang agak kuat. Keputusan ini membabitkan potensi resveratrol sebagai mimetik CR.
Singkatan
AAPH, 2,2′-azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride; AMPK, kinase protein diaktifkan adenosin monofosfat; ANOVA, analisis varians; AROS, pengawal selia aktif SIRT1; CR, sekatan kalori; DBC1, dipadamkan dalam kanser payudara 1; D-gal, D-galaktosa; FBS, serum lembu janin; Foxo3a, kotak forkhead 3a; HuR, Hu antigen R; MEM, medium penting minimum; PBS, garam penampan fosfat; PGC-1 , reseptor G coactivator diaktifkan proliferator peroksisom-1 ; RES, resveratrol; SA -gal, senescence-associated -galactosidase; SD, sisihan piawai; SIRT1, menyenyapkan pengawal selia maklumat; TE, telomerase.
Sumbangan pengarang
Konsep dan reka bentuk penyelidikan: Gang Chen; pemerolehan, analisis dan tafsiran data: Juan Li, Xia Chun Zhang, Yi-Mei Liu; mendapatkan pembiayaan dan semakan kritikal manuskrip untuk kandungan intelektual: Gang Chen, Ke-Li Chen; penulisan manuskrip: Juan Li. Semua penulis telah membaca dan meluluskan penerbitan manuskrip ini. PENGHARGAAN DAN PEMBIAYAAN
Kerja ini dibiayai oleh China Postdoctoral Science Foundation (2016M601237), projek Natural Science Foundation (81373704, 30873292).
KONFLIK KEPENTINGAN
Tiada konflik kepentingan daripada semua pengarang yang mengambil bahagian.
RUJUKAN
1. Ramis MR, Esteban S, Miralles A, Tan DX, Reiter RJ. Sekatan kalkorik, resveratrol dan melatonin: Peranan SIRT1 dan implikasi untuk penuaan dan penyakit berkaitan. Mech Penuaan Dev. 2015; 146–148:28–41.
2. Colman RJ, Beasley TM, Kemnitz JW, Johnson SC, Weindruch R, Anderson RM. Sekatan kalori mengurangkan kematian berkaitan usia dan semua sebab dalam monyet rhesus. Nat Commun. 2014; 5:3557.
3. Sohal RS, Weindruch R. Tekanan oksidatif, sekatan kalori, dan penuaan. Sains. 1996; 273:59–63.
4. Testa G, Biasi F, Poli G, Chiarpotto E. Sekatan kalori dan mimetik sekatan diet: strategi untuk meningkatkan penuaan yang sihat dan panjang umur. Curr Pharm Des. 2014; 20:2950–77.
5. Lorong MA, Roth GS, Ingram DK. Mimetik sekatan kalori: pendekatan baru untuk biogerontologi. Kaedah Mol Biol. 2007; 371:143–9.
6. Baur JA, Pearson KJ, Price NL, Jamieson HA, Lerin C, Kalra A, Prabhu VV, Allard JS, Lopez-Lluch G, Lewis K, Pistell PJ, Poosala S, Becker KG, et al. Resveratrol meningkatkan kesihatan dan kemandirian tikus dalam diet tinggi kalori. alam semula jadi. 2006; 444:337–42.
7. Lagouge M, Argmann C, Gerhart-Hines Z, Meziane H, Lerin C, Daussin F, Messadeq N, Milne J, Lambert P, Elliott P, Geny B, Laakso M, Puigserver P, et al. Resveratrol meningkatkan fungsi mitokondria dan melindungi daripada penyakit metabolik dengan mengaktifkan SIRT1 dan PGC{3}}alfa. sel. 2006; 127:1109–22.
8. Howitz KT, Bitterman KJ, Cohen HY, Lamming DW, Lavu S, Wood JG, Zipkin RE, Chung P, Kisielewski A, Zhang LL, Scherer B, Sinclair DA. Pengaktif molekul kecil sirtuin memanjangkan jangka hayat Saccharomyces cerevisiae. alam semula jadi. 2003; 425:191–6.
9. Kwon HS, Ott M. Turun naik SIRT1. Trends Biochem Sci. 2008; 33:517–25.
10. Brooks CL, Gu W. Bagaimanakah SIRT1 menjejaskan metabolisme, penuaan dan kanser? Nat Rev Kanser. 2009; 9:123–8.
11. Harman D. Teori penuaan radikal bebas. Mutat Re. 1992; 275:257–66.
12. Mayo JC, Tan DX, Sainz RM, Lopez-Burillo S, Reiter RJ. Kerosakan oksidatif kepada katalase yang disebabkan oleh radikal peroksil: perlindungan berfungsi oleh melatonin dan antioksidan lain. Percuma Radic Res. 2003; 37:543–53.
13. Hubackova S, Krejcikova K, Bartek J, Hodny Z. IL1- dan isyarat TGF -Nox4, tekanan oksidatif dan tindak balas kerosakan DNA ialah ciri dikongsi paracrine 'Bystander senescence' replikatif, akibat onkogen dan akibat dadah '. Penuaan (Albany NY). 2012; 4:932–51. https:// doi.org/10.18632/aging.100520.
14. Cui X, Zuo P, Zhang Q, Li X, Hu Y, Long J, Packer L, Liu J. Pendedahan D-galaktosa sistemik kronik mendorong kehilangan ingatan, neurodegenerasi dan kerosakan oksidatif pada tikus: Kesan perlindungan R{{ 2}}asid lipoik. J Neurosci Res. 2006; 84:647–54.
Minta lebih lanjut:
E-mel:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: tambah 86 15292862950
