Abstrak

Kemurungan mewakili gangguan psikiatri yang sangat berleluasa dan melumpuhkan di seluruh dunia. Bukti yang semakin meningkat menunjukkan bahawa pengaktifan neuroinflamasi yang berlebihan dalam hippocampus menyumbang dengan ketara kepada permulaan dan perkembangan gejala kemurungan. Cistanche phenylethanol glycosides (CPhGs), juzuk bioaktif utama yang diekstrak daripada herba perubatan tradisional yang boleh dimakanCistanche deserticoladanCistanche tubulosa, telah memaparkan pelbagai sifat farmakologi neuroprotektif dalam kajian terdahulu. Penyiasatan sekarang ini bertujuan untuk meneroka kesan terapeutik dan mekanisme molekul yang dikenakan oleh CPhGs pada fenotip tingkah laku seperti kemurungan yang dicetuskan oleh tekanan ringan kronik yang tidak dapat diramalkan (CUMS) dalam tikus C57BL/6.

Enam puluh tikus C57BL/6 gred SPF dipisahkan secara rawak kepada enam kohort eksperimen: kumpulan kawalan, kumpulan model CUMS, kumpulan CPhGs dos tinggi (700 mg/kg), kumpulan CPhGs dos sederhana (350 mg/kg), kumpulan CPhGs dos rendah (175 mg/kg) dan positif. mg/kg). Selepas empat minggu campur tangan gavage ubat berikutan pemodelan CUMS, penilaian neurobehavioral yang komprehensif termasuk ujian keutamaan sukrosa (SPT), ujian medan terbuka (OFT), ujian penggantungan ekor (TST) dan ujian renang paksa (FST) telah dilaksanakan. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit mengukur kepekatan neurotransmitter monoamine serum, bersama-sama sitokin pro-radang hippocampal dan mediator keradangan. Pewarnaan hematoxylin‑eosin (HE) dan pewarnaan Nissl menggambarkan kecederaan patologi neuron di dalam kawasan gyrus dentate hippocampal. Imunohistokimia mengesan intensiti ekspresi protein berasid fibrillary glial (GFAP), molekul penyesuai pengikat kalsium terion-1 (Iba-1), NLRP3, dan protein Caspase-1. Pewarnaan imunofluoresensi menilai status pengaktifan huluan TLR4/NF‑κB lata isyarat.

Hasil eksperimen kami menunjukkan bahawa pentadbiran CPhG oral sangat mengurangkan keabnormalan tingkah laku yang berkaitan dengan kemurungan. CPhGs meningkatkan peratusan keutamaan sukrosa dan mengurangkan tempoh imobilitas dalam paradigma tingkah laku berasaskan putus asa. Selain itu, rawatan CPhGs memulihkan serum yang habis dan serotonin hippocampal (5-HT) serta tahap dopamin (DA). Pengesanan biokimia mendedahkan penindasan ketara terhadap mediator pro-radang hippocampal dan pengeluaran berlebihan sitokin. Pemerhatian histopatologi menggambarkan pelepasan bergantung kepada dos terhadap kerosakan neuron hippocampal yang ditimbulkan oleh CUMS. Keputusan imunohistokimia menunjukkan bahawa CPhG menambah ketumpatan astrocyte yang ditandakan oleh GFAP, menghalang hiperaktivasi patologi mikroglia Iba-1-positif, dan kelimpahan protein yang berkaitan dengan keradangan NLRP3 yang terkawal. Ujian imunofluoresensi mengesahkan bahawa CPhG menghalang pengaktifan TLR4 dan fosforilasi NF‑κB p65 yang berlebihan dalam tisu hippocampal.

Secara kolektif, penemuan ini mengesahkan bahawa CPhG mempunyai keberkesanan seperti antidepresan yang menonjol terhadap manifestasi seperti kemurungan yang dirangsang CUMS pada tikus. Mekanisme farmakologinya dimediasi sebahagiannya melalui fungsi pengawalseliaan dua: memulihkan homeostasis neurotransmitter monoamine dan menahan tindak balas neuroinflamasi yang dimediasi oleh paksi isyarat TLR4/NF‑κB/NLRP3. Kajian haiwan ini membekalkan asas eksperimen pra-klinikal yang menyokong eksploitasi lanjut CPhG sebagai agen calon semula jadi yang menjanjikan atau bahan makanan berfungsi untuk campur tangan pembantu kemurungan.

Kata kunci: Cistanche phenylethanol glycosides (CPhGs); kemurungan; tekanan ringan kronik yang tidak dapat diramalkan; keradangan saraf; astrosit; mikroglia; Laluan radang TLR4/NF‑κB/NLRP3

1. Pengenalan

Kemurungan ialah penyakit psikiatri afektif pelbagai rupa yang dicirikan oleh manifestasi klinikal teras yang terdiri daripada mood rendah yang berterusan, anhedonia, terencat psikomotor, gangguan tidur-bangun dan disfungsi somatik. Episod kemurungan yang teruk berpotensi membawa kepada kemudaratan diri dan idea untuk membunuh diri, menyebabkan beban kesihatan awam yang besar di seluruh dunia. Data tinjauan epidemiologi dari China melaporkan kelaziman kemurungan negara mencecah 2.1%, dan Pertubuhan Kesihatan Sedunia telah mengklasifikasikan gangguan kemurungan utama antara penyakit peringkat teratas yang menyumbang kepada kehilangan hayat tahun yang diselaraskan ketidakupayaan global.

Walau bagaimanapun, etiologi molekul lengkap yang mendasari patogenesis kemurungan masih belum dijelaskan sepenuhnya, menghalang penyelesaian terapeutik klinikal yang sempurna. Hipotesis patofisiologi kontemporari telah mengalihkan tumpuan ke arah mekanisme crosstalk neuro-imun. Mengumpul penyelidikan pra-klinikal dan klinikal menyerlahkan keradangan saraf yang berterusan sebagai pemacu patogen yang penting untuk gangguan kemurungan. Di bawah cabaran tekanan psikologi atau fisiologi yang kronik, populasi sel glial hippocampal mengalami pengaktifan yang tidak normal. Mikroglia yang terlalu aktif dan astrosit yang tidak berfungsi mencetuskan pembebasan teguh berbilang mediator pro-radang, mewujudkan kesan amplifikasi lata sitokin pro-radang. Penghinaan neuro-radang sedemikian seterusnya mendorong kemerosotan morfologi neuron, gangguan metabolik neurotransmitter dan kemerosotan keplastikan sinaptik, akhirnya memudahkan perkembangan patologi seperti kemurungan.

Intervensi antidepresan klinikal arus perdana semasa kebanyakannya bergantung pada antidepresan kimia sintetik yang diwakili oleh fluoxetine, perencat pengambilan semula serotonin terpilih (SSRI). Walaupun separa melegakan simptom untuk pesakit tertentu, antidepresan sintetik mempunyai kelemahan yang diiktiraf dengan baik: nisbah remisi lengkap yang tidak memuaskan, simptom kemurungan yang berterusan, kebarangkalian berulang yang tinggi selepas pemberhentian ubat, serta kesan sampingan gastrousus, hepatik dan metabolik semasa pentadbiran jangka panjang. Sebaliknya, ubat-ubatan herba tradisional mempunyai ciri-ciri modulasi berbilang sasaran dan profil keselamatan yang agak ringan, oleh itu menarik minat penyelidikan yang semakin meningkat untuk terapi adjuvant gangguan mood.

Cistanche deserticoladanCistanche tubulosa, biasanya dinamakan "ginseng gurun", tergolong dalam keluarga Orobanchaceae. Batang berdaging mereka berfungsi sebagai bahan mentah makanan perubatan homolog klasik dalam amalan herba tradisional Asia. Penyiasatan farmakologi moden mendokumenkan pelbagai bioaktiviti neuroprotektif untukCistancheekstrak, termasuk kesan anti-neurodegenerasi terhadap penyakit Alzheimer dan penyakit Parkinson. Phenylethanol glycosides membentuk pecahan bioaktif utama di dalamnyaCistancheekstrak, terutamanya mengandungi echinacoside dan verbascoside. Cistanche phenylethanol glycosides (CPhGs) mempamerkan bioaktiviti anti-tumor, antioksidan, imunomodulator dan neuro-pelindung merentas pelbagai platform eksperimen.

Kerja makmal awal sebelum ini telah menunjukkan bahawa CPhG boleh meningkatkan kepekatan dopamin striatal dan mengurangkan fenotip seperti kemurungan yang berkaitan menopaus dalam model haiwan tikus. Walau bagaimanapun, sama ada CPhG menghasilkan pengaruh perlindungan terhadap kemurungan yang dicetuskan oleh tekanan kronik, dan lata transduksi isyarat terperinci yang menjadi pengantara bioaktiviti tersebut masih kurang penerokaan sistematik. Paradigma haiwan tekanan ringan yang tidak dapat diramalkan kronik (CUMS) berdiri sebagai satu model kemurungan pra-klinikal yang mantap. Dengan mendedahkan tikus makmal kepada tekanan ringan rawak yang pelbagai selama beberapa minggu berturut-turut, CUMS dengan pasti menyusun semula ciri kemurungan teras seperti anhedonia, keputusasaan tingkah laku dan kerosakan neuropatologi hippocampal.

Sehubungan itu, penyelidikan ini membina model tetikus kemurungan yang disebabkan oleh CUMS untuk menilai secara sistematik potensi seperti antidepresan in-vivo bagi tiga dos kecerunan CPhGs. Kami memberi tumpuan terutamanya pada pemulihan neurotransmitter monoamine, transformasi fenotip sel glial hippocampal, dan laluan neuro-radang radang NLRP3 yang dikawal oleh TLR4/NF‑κB. Kajian ini berhasrat untuk memberikan bukti eksperimen objektif untuk menyokong pembangunan farmaseutikal masa depan dan aplikasi makanan berfungsi CPhG yang menyasarkan peningkatan gejala kemurungan.

2. Bahan dan Kaedah

2.1 Bahan Eksperimen, Reagen dan Instrumen

Ekstrak mentah CPhGs standard diperoleh daripada Hotan Dichen Pharmaceutical Biological Co., Ltd (No kumpulan. 20231221, Xinjiang, China). Jumlah kandungan phenylethanol glikosida Lebih daripada atau sama dengan 85 %, mengandungi echinacoside Lebih besar daripada atau sama dengan 40 % dan verbascoside Lebih daripada atau sama dengan 16 %. Kapsul fluoxetine hidroklorida diperoleh dari Patheon France. Kit ujian ELISA komersial untuk 5‑HT, DA, iNOS, COX‑2, PGE2, TNF‑, IL‑1, IL‑18, IL‑6, IFN‑ diperoleh daripada pembekal reagen biologi yang berkelayakan. Antibodi utama yang digunakan untuk imunohistokimia dan imunofluoresensi termasuk antibodi anti-GFAP, anti-Iba‑1, anti-NLRP3, anti-Caspase-1, anti-TLR4 dan anti-phospho‑NF‑κB p65. Kit pewarnaan histologi untuk pewarnaan HE dan Nissl telah disediakan untuk pemprosesan bahagian otak parafin.

Instrumen analisis makmal utama meliputi imbangan analitik elektronik berketepatan tinggi, stesen kerja penulenan air ultratulen Milli‑Q, pembaca plat mikro pelbagai mod SpectraMax, mikroskop pendarfluor tegak Leica, serta perkakasan analisis tingkah laku tikus yang lengkap dan sistem perisian pengesan gerakan SMART 3.0.

Tikus C57BL/6 lelaki gred SPF 60 jantan, berumur tujuh minggu dengan julat berat badan awal 18‑22 g, telah dibeli daripada Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. Semua manipulasi eksperimen tetikus mendapat kelulusan etika rasmi oleh Jawatankuasa Etika Haiwan Perubatan ID Shaanxis: Universiti China SUCMDL20231015003). Tikus ditempatkan di dalam kemudahan perumahan haiwan bebas patogen khusus. Parameter alam sekitar dikekalkan pada suhu ambien (21 ± 2) darjah , kelembapan bandingan 60 % ± 10 %, melaksanakan kitaran pencahayaan terang-gelap standard 12 jam. Ayam tikus dan air minuman boleh diakses secara ad libitum. Tempoh penyesuaian penyesuaian satu minggu telah dilakukan sebelum memulakan aliran kerja percubaan formal.

2.2 Pengelompokan Haiwan, Permodelan CUMS dan Pentadbiran Dadah

Selepas peningkatan adaptif satu minggu, saringan keutamaan sukrosa awal mengecualikan tikus individu dengan keutamaan minuman rendah gula yang wujud. Tikus percubaan yang layak telah rawak kepada enam kumpulan kajian (n = 10 haiwan dalam setiap kumpulan):

Kumpulan kawalan (Con): tiada tekanan CUMS, pentadbiran intragastrik air ternyahion isovolumetric;

Kumpulan model CUMS (Mod): menerima rangsangan CUMS penuh, gavage dengan air ternyahion volum yang sama;

Kumpulan CPhGs dos tinggi (CPhGs‑H): Pendedahan CUMS, CPhGs 700 mg/kg berat badan mengikut gavage harian;

Kumpulan CPhGs dos sederhana (CPhGs‑M): Pendedahan CUMS, CPhGs 350 mg/kg mengikut gavage harian;

Kumpulan CPhGs dos rendah (CPhGs‑L): Pendedahan CUMS, CPhGs 175 mg/kg mengikut gavage harian;

Kumpulan kawalan positif Fluoxetine (FLX): Pendedahan CUMS, fluoxetine 15 mg/kg gavage sekali sehari.

Untuk pembinaan model CUMS, sepuluh jenis tekanan ringan yang berbeza telah diterima pakai: kekangan fizikal (60 min), goncangan mendatar (60 min), suspensi ekor (60 min), sangkar condong sudut 45-darjah (24 jam), persekitaran tempat tidur lembap (24 jam), pengasingan sangkar kosong (24 jam), berenang dengan cahaya panas semalaman 41 darjah selama 5 minit, berenang air sejuk pada 4 darjah selama 5 minit, dan rangsangan klip ekor berlangsung selama 2 minit. Dua tekanan yang berbeza digunakan secara rawak setiap hari; tekanan yang sama tidak akan muncul berturut-turut pada dua hari bersebelahan. Prosedur pemodelan CUMS berterusan selama empat minggu.

Selepas menyelesaikan pemodelan tegasan empat minggu, bahan ujian atau kenderaan pelarut yang sepadan dihantar secara intragastrik sekali sehari selama empat minggu berterusan. Pada minggu percubaan kelapan, semua projek pengesanan neurobehavioral dilaksanakan secara berurutan.

2.3 Bateri Ujian Neuro-Tingkah Laku

2.3.1 Ujian Keutamaan Sukrosa (SPT)

Ujian keutamaan sukrosa menilai fenotip kemurungan teras seperti anhedonia dalam tikus. Sebelum pengukuran rasmi, setiap tetikus ditempatkan secara individu. Fasa penyesuaian minuman sukrosa tiga hari telah dilaksanakan. Hari-satu: dua botol larutan sukrosa 1% diletakkan di dalam setiap sangkar selama 24 jam. Hari-kedua: satu botol larutan sukrosa dipasangkan dengan satu botol air tulen. Hari ketiga: tukar kedudukan bekas gula-air dan air tulen untuk menghapuskan pengaruh berat sebelah lokasi. Selepas kitaran penyesuaian, tikus berpuasa daripada makanan dan air selama 24 jam. Selepas itu, botol air sukrosa pra-timbang 1% dan botol air tulen telah disediakan. Kedudukan botol ditukar selepas 12 jam. Selepas jumlah tempoh ujian 24 jam, baki berat cecair kedua-dua botol direkodkan dengan tepat. Kadar keutamaan sukrosa (%)=(penggunaan larutan sukrosa)/(penggunaan larutan sukrosa + penggunaan air tulen) × 100 %.

2.3.2 Ujian Medan Terbuka (OFT)

Radas medan terbuka membentuk kotak padu atas terbuka 50 cm × 50 cm × 50 cm. Kawasan persegi tengah ditakrifkan sebagai zon tengah 25 cm × 25 cm yang berpusat di dalam arena. Setiap tetikus diletakkan perlahan-lahan pada permukaan tengah kotak medan terbuka. Masa penyesuaian percuma selama lima minit dibenarkan. Perekodan tingkah laku dan analisis data tertumpu pada tempoh pemerhatian lima minit berikutnya. Penunjuk bacaan utama mengandungi jumlah jarak pergerakan, masa yang dihabiskan di dalam zon tengah dan kekerapan kemasukan zon tengah. Parameter ini mencerminkan aktiviti lokomotor spontan dan kesanggupan meneroka di bawah keadaan persekitaran yang tidak biasa.

2.3.3 Ujian Penggantungan Ekor (TST)

Bahagian ekor tetikus dibetulkan dengan selamat membolehkan haiwan tergantung terbalik di atas permukaan tanah. Jumlah masa rakaman ialah enam minit. Tempoh masa tidak bergerak semasa segmen empat minit kemudian telah didokumenkan. Peningkatan masa imobilitas mewakili status seperti kemurungan tingkah laku-putus asa yang dipertingkatkan.

2.3.4 Ujian Renang Paksa (FST)

Tong renang silinder telus (diameter 15 cm, ketinggian 50 cm) diisi dengan air yang dikekalkan pada (25 ± 2) darjah; kedalaman air mencapai 20 cm. Setiap tetikus diletakkan perlahan-lahan ke dalam bekas renang selama enam minit jumlah selang rakaman. Masa imobilitas terapung empat minit terakhir dikira secara statistik. Tempoh imobiliti yang lebih lama menunjukkan prestasi tingkah laku berkaitan keputusasaan yang semakin meningkat.

2.4 Pengumpulan Sampel dan Penyediaan Tisu

Pada titik terminal percubaan minggu-8, tikus menjalani suntikan intraperitoneal 3% natrium pentobarbital (10 mL/kg) untuk anestesia dalam. Spesimen darah telah dituai melalui teknik pendarahan penyingkiran bola mata. Selepas itu euthanasia dislokasi serviks dilakukan. Perfusi jantung normal-salinan sejuk membersihkan darah yang beredar di dalam tisu serebrum. Spesimen seluruh otak yang lengkap dibedah dengan cepat. Satu-separuh tisu otak telah direndam dalam 4% larutan paraformaldehid selama 72 jam penetapan tisu untuk histologi berikutnya. Kawasan otak hippocampal telah diasingkan dengan cepat daripada spesimen otak yang tinggal pada platform ais yang telah disejukkan dan dipelihara di dalam persekitaran penyimpanan nitrogen cecair. Untuk pengukuran biokimia, 10 mg sampel tisu hippocampal dicampur dengan garam normal pra-disejukkan berikutan nisbah jisim isipadu 1:9, menjalani homogenisasi mekanikal mandi ais. Homogenat tisu telah disentrifugasi di bawah 4000 r/min selama 15 minit, dan pecahan supernatan dikumpul untuk kuantifikasi biomarker ELISA.

2.5 Pengukuran Indeks Biokimia

Menurut manual pengendalian pengilang kit ELISA komersial, sampel supernatan serum dan homogenat hippocampal diukur untuk memperoleh nilai kepekatan neurotransmitter monoamine termasuk 5-HT dan DA. Supernatan homogenat hippocampal telah diuji selanjutnya untuk penunjuk pengantara radang iNOS, COX‑2, PGE2, bersama sitokin pro-radang TNF‑, IL‑1, IL‑18, IL‑6 dan IFN‑. Bacaan penyerapan ketumpatan optik telah ditangkap melalui spektrofotometer mikroplat. Kepekatan protein sampel telah ditentukur menggunakan kit kuantifikasi protein BCA sebelum pengesanan sitokin.

2.6 Pewarnaan Histopatologi Hippocampal

Sampel tisu otak tetap telah dibenamkan dalam lilin parafin dan dihiris kepada bahagian histologi ketebalan 4μm. Untuk pewarnaan HE: bahagian parafin melalui dewaxing xilena, penghidratan etanol kecerunan, pewarnaan nuklear hematoksilin, pewarnaan balas sitoplasma eosin, pembezaan alkohol-hidroklorik, dehidrasi etanol kecerunan, rawatan ketelusan xilena dan pelekap gusi neutral. Pemerhatian mikroskopik tertumpu pada morfologi selular, status nuklear dan integriti struktur sitoplasma dalam kawasan gyrus dentate hippocampal.

Pewarnaan Nissl menggambarkan korpuskel Nissl neuron yang mencerminkan aktiviti biosintetik neuron dan daya hidup sel. Potongan parafin dewaxed telah diinkubasi dalam larutan kerja pewarnaan Nissl. Selepas langkah membasuh air suling, bahagian menerima dehidrasi, prosedur ketelusan dan pengedap. Variasi histomorfologi neuron hippocampal diperhatikan di bawah mikroskop optik.

2.7 Ujian Imunohistokimia

Bahagian tisu hippocampal yang dibenamkan parafin telah didewax dan dihidratkan. Pengambilan semula antigen, penyekatan peroksidase endogen dan langkah-langkah penyekatan pengikat protein tidak spesifik telah dilaksanakan secara berurutan. Kepingan tisu diinkubasi semalaman pada suhu 4 darjah dengan antibodi primer yang dicairkan: anti-GFAP (1:400), anti-Iba-1 (1:400), anti-NLRP3 (1:300), anti-Caspase-1 (1:400). Selepas pengeraman antibodi sekunder, tindak balas kromogenik DAB dilakukan. Prosedur pewarnaan balas nukleus, dehidrasi dan pemasangan telah selesai. Imej medan pandangan digital yang ditangkap oleh mikroskop cahaya. Perisian pemprosesan imej-J imej-J mengira purata nilai ketumpatan optik untuk menilai secara separa kuantitatif keamatan ekspresi protein sasaran.

2.8 Pewarnaan Imunofluoresensi

Bahagian hippocampal parafin yang disediakan mengalami dewaxing, pengambilan antigen dan operasi menyekat. Antibodi utama anti-TLR4 (1:400) dan anti-phospho‑NF‑κB p65 (1:200) telah digunakan dan diinkubasi semalaman pada keadaan empat darjah Celcius. Antibodi sekunder berlabel pendarfluor telah ditambah untuk pengeraman satu jam di bawah status pelindung cahaya. Noda balas nuklear DAPI disertakan dalam medium pelekap. Mikroskop pendarfluor laser memotret isyarat pendarfluor. Perisian Image‑J mengira purata keamatan pendarfluor yang mewakili magnitud pengaktifan protein TLR4 dan p‑NF‑κB p65.

2.9 Analisis Statistik

Data eksperimen asal telah diproses menggunakan perisian statistik SPSS 26.0 dan program grafik GraphPad Prism 9.0. Semua data hasil kuantitatif dinyatakan sebagai min ± sisihan piawai (\\(\\bar{x} \\pm s\\)). Perbandingan statistik antara kumpulan telah dijalankan dengan ujian statistik yang sesuai. Nilai P kurang daripada 0.05 dinilai sebagai perbezaan yang signifikan secara statistik; P< 0.01 represented highly significant statistical distinction.

3. Keputusan Eksperimen

3.1 CPhG Meningkatkan Simptom Anhedonia dan Tahap Neurotransmitter Monoamine Dipulihkan

Sebelum permulaan pemodelan CUMS, kadar keutamaan sukrosa asas tidak menunjukkan varians statistik yang jelas merentas semua kohort haiwan eksperimen. Selepas tekanan CUMS empat minggu ditambah kitaran intervensi empat minggu, kumpulan model CUMS mempamerkan nisbah keutamaan sukrosa yang menurun berbanding haiwan kawalan tidak tertekan (P< 0.01), demonstrating successful establishment of anhedonia depressive‑like phenotype. Serum and hippocampal tissue 5‑HT and DA concentrations in Mod group were significantly reduced compared with Con group (P < 0.05 or P < 0.01).

Berbanding dengan kohort model Mod, kumpulan rawatan CPhGs dos tinggi, sederhana dan rendah serta kumpulan positif fluoxetine menjana ketinggian yang ketara pada peratusan keutamaan sukrosa, serum 5-HT, serum DA, hippocampal 5-HT dan kandungan DA hippocampal (P< 0.05 or P < 0.01). Pharmacological improvement effect exhibited apparent dose‑dependent tendency; high‑dose CPhGs group achieved more robust biomarker‑rescue outcome than medium‑dose and low‑dose subgroups. This set of findings illustrated CPhGs could ameliorate anhedonic behavioral performance and reverse stress‑provoked depletion of key mood‑regulating monoamine neurotransmitters inside peripheral circulation and hippocampal brain tissue.

3.2 Aktiviti Penerokaan Dipertingkatkan CPhG dalam Ujian Medan Terbuka

Dalam penilaian tingkah laku medan terbuka, tikus model CUMS menunjukkan pengurangan yang luar biasa pada jumlah jarak pergerakan, masa tinggal zon tengah dan kekerapan kemasukan wilayah tengah berbanding tikus kawalan (P< 0.01). Chronic unpredictable stress suppressed spontaneous exploratory behaviors. Following CPhGs or fluoxetine intervention, those three open‑field‑test indicators increased observably (P < 0.05 or P < 0.01). High‑dose CPhGs‑treated mice displayed 46.63 % increase of total travel distance, 127.92 % growth of central‑zone residence time compared against Mod group. Medium‑dose and low‑dose CPhGs also produced measurable but weaker improvement effects. It indicated CPhGs alleviated stress‑induced suppression of autonomous exploration activity.

3.3 CPhGs Memendekkan Masa Imobiliti dalam Paradigma Tingkah Laku Berasaskan Keputusasaan

Ujian penggantungan ekor dan ujian renang paksa mengesan keputusasaan tingkah laku, yang mewakili pembacaan tingkah laku seperti kemurungan teras. Kumpulan Mod memaparkan masa imobilitas yang berpanjangan secara drastik dalam kedua-dua TST dan FST (P< 0.01) relative to Con group. After drug intervention, CPhGs‑H, CPhGs‑M, CPhGs‑L and FLX groups generated statistically significant shortening of immobility durations (P < 0.05 or P < 0.01). For forced‑swim immobility time, high‑dose CPhGs brought 34.67 % reduction; medium‑dose 30.71 % reduction; low‑dose 20.78 % reduction. For tail‑suspension immobile time: CPhGs‑H achieved 35.91 % decrease. Results suggested CPhGs mitigated despair‑related passive coping behavioral patterns triggered by long‑term unpredictable stress stimulation.

3.4 CPhGs Mengurangkan Sitokin Pro-Inflamasi Hippocampal Berlebihan

Kepekatan sitokin pro-radang hippocampal (TNF‑, IL‑1, IL‑18, IL‑6, IFN‑ ) dalam haiwan model CUMS meningkat secara drastik berbanding dengan rakan kawalan (P< 0.01). After CPhGs intervention, these pro‑inflammatory cytokine contents descended in dose‑responsive fashion. High‑dose CPhGs generated the most powerful inhibitory influence. For instance, relative to Mod group, CPhGs‑H decreased TNF‑α level by 42.93 %, lowered IL‑1β by 45.72 %, and reduced IL‑18 by 35.17 %. Medium‑dose CPhGs delivered moderate anti‑inflammatory potency, and low‑dose group exerted limited but detectable inhibitory impacts. This data demonstrated CPhGs could suppress excessive pro‑inflammatory‑cytokine release inside hippocampal tissue under chronic‑stress challenge.

3.5 CPhGs Down‑Regulated Hippocampal Inflammatory‑Mediator Biomarkers

Pengantara radang hippocampal iNOS, COX‑2 dan PGE2 dalam tikus model CUMS meningkat dengan ketara (P< 0.01). After drug intervention, CPhGs‑H, CPhGs‑M markedly diminished iNOS, COX‑2 and PGE2 concentrations (P < 0.05 or P < 0.01). Low‑dose CPhGs‑L group showed limited statistical significance for partial indicators. High‑dose CPhGs treatment group exhibited iNOS reduction rate reaching 49.55 %, COX‑2 reduction 39.58 %. Collectively, CPhGs suppressed stress‑induced up‑regulation of inflammatory‑mediator molecules inside hippocampus.

3.6 Kecederaan Patologi Neuronal Hippocampal yang Dilemahkan CPhGs CUMS yang Dicetuskan

Hasil pewarnaan HE: neuron hippocampal dentate-gyrus daripada kumpulan Mod menunjukkan lesi patologi yang teruk: susunan selular tidak teratur, nukleus pyknosis, degenerasi vakuolar sitoplasma, menunjukkan kerosakan neuron yang ketara. Kumpulan CPhGs-L hanya menunjukkan kesan peningkatan yang remeh. CPhG dos sederhana dan tinggi jelas membalikkan perubahan patologi sedemikian; kumpulan CPhGs‑H dos tinggi menunjukkan kesan perlindungan neuron yang unggul berbanding kumpulan fluoxetine dalam medan visual separa.

Hasil pewarnaan Nissl: Neuron hippocampal kumpulan mod menunjukkan susunan tidak teratur, pengurangan ketara kuantiti corpuscle Nissl, yang mencerminkan fungsi sintetik neuron terjejas dan daya hidup selular yang rendah. Pentadbiran CPhGs bergantung kepada dos memulihkan kelimpahan badan Nissl. Morfologi neuron dan ketumpatan Nissl‑corpuscle dalam kumpulan CPhGs‑H menghampiri tahap kumpulan kawalan normal. Penemuan histopatologi mengesahkan CPhGs melindungi integriti neuron hippocampal daripada kemusnahan pengantara tekanan kronik.

3.7 Status Pengaktifan Sel Hippocampal Glial Terkawal CPhG

GFAP ialah biomarker khusus untuk populasi astrocyte. Berbanding dengan kumpulan Con, keamatan isyarat positif GFAP hippocampal kumpulan Mod menurun dengan ketara (P< 0.01), indicating massive astrocyte functional impairment induced by CUMS stress. CPhGs‑H and CPhGs‑M intervention groups distinctly elevated GFAP expression level (P < 0.05 or P < 0.01); high‑dose CPhGs‑H enhanced GFAP average optical density by 64.23 % relative to Mod group. Low‑dose CPhGs‑L generated upward trend without statistical significance.

Penanda protein Iba‑1 mewakili mikroglia. Kumpulan model CUMS memaparkan isyarat ekspresi positif Iba‑1 meningkat secara mendadak (P< 0.01), implying robust microglia hyper‑activation. After CPhGs intervention, Iba‑1 expression intensity decreased dose‑dependently. CPhGs‑H produced 23.73 % reduction of Iba‑1 optical‑density value versus Mod group. It illustrated CPhGs preserved astrocyte abundance while dampening pathological microglia over‑activation inside hippocampal compartments.

3.8 CPhGs Menghalang Hippocampal NLRP3‑Inflammasom‑Related‑Ungkapan Protein

Pengesanan imunohistokimia menunjukkan ekspresi protein NLRP3 dan Caspase‑1 di dalam hippocampus kumpulan Mod telah dikawal dengan ketara (P< 0.01). Following CPhGs treatment, NLRP3 and Caspase‑1 protein abundance declined dose‑responsively. High‑dose CPhGs‑H decreased NLRP3 expression by 50.00 %, lowered Caspase‑1 expression level by 57.65 %. It demonstrated CPhGs suppressed pathological NLRP3 inflammasome complex activation in CUMS‑damaged hippocampal tissue.

3.9 CPhG Ditindas Pengaktifan Berlebihan Laluan Isyarat TLR4/NF‑κB

Pengesanan imunofluoresensi menunjukkan bahawa tikus model CUMS menunjukkan intensiti pendarfluor yang dipertingkatkan dengan ketara bagi reseptor TLR4 dan subunit NF‑κB p65 terfosforilasi (P< 0.01). CPhGs intervention obviously reduced TLR4 and p‑NF‑κB p65 fluorescence signal strength (P < 0.05 or P < 0.01). Combined with above‑mentioned NLRP3 inflammasome‑protein detection results, these observations supported the inference: CPhGs inhibited TLR4/NF‑κB upstream signal‑cascade hyper‑activation, which sequentially restrained downstream NLRP3 inflammasome assembly and neuro‑inflammatory cascade amplification.

4. Perbincangan

Gangguan kemurungan utama membentuk penyakit neuropsikiatri yang teruk. Dalam beberapa tahun kebelakangan ini, teori kemurungan neuro-radang telah menarik perhatian penyelidikan yang meluas. Tekanan psikologi berulang yang kronik boleh mencetuskan pengaktifan sistem imun semula jadi di dalam sistem saraf pusat. Hippocampus, satu kawasan otak yang sangat terdedah kepada penghinaan tekanan, berkait rapat dengan modulasi mood, pemprosesan ganjaran dan fungsi ingatan. Di bawah rangsangan tekanan yang berterusan, homeostasis sel glial hippocampal runtuh. Mikroglia yang hiperaktif dan astrosit yang rosak merembeskan sejumlah besar sitokin pro-radang, menimbulkan kecederaan struktur neuron, gangguan metabolik monoamine-neurotransmitter, akhirnya menggalakkan kemunculan tingkah laku seperti kemurungan.

Produk semula jadi aktif berasaskan herba tradisional mempunyai kelebihan farmakologi pelbagai sasaran, menjadi sumber calon yang menjanjikan untuk penemuan ubat antidepresan. CPhG ialah komponen bio-aktif tandatangan yang diasingkan daripadaCistancheherba perubatan. Penyelidikan ini membina model tetikus kemurungan tekanan kronik akibat CUMS, mengesahkan keberkesanan in-vivo antidepresan seperti CPhGs kecerunan. Keputusan eksperimen tingkah laku menunjukkan bahawa rawatan CPhGs memperbaiki gejala anhedonia dengan ketara, meningkatkan aktiviti penerokaan, dan mengurangkan masa imobilitas yang berkaitan dengan putus asa dalam tikus model kemurungan, menunjukkan korelasi kesan dos yang jelas.

Hipotesis neurotransmitter monoamine ialah teori patogenesis kemurungan klasik. Serotonin dan dopamin menjalankan peranan pengawalseliaan kritikal yang meliputi penstabilan emosi, persepsi maklum balas ganjaran dan modulasi tingkah laku yang berkaitan dengan motivasi. Tekanan CUMS membawa kepada penurunan jelas kepekatan 5-HT dan DA dalam tisu serum dan hippocampal dalam haiwan model kami. Campur tangan CPhG secara berkesan memulihkan kedua-dua tahap neurotransmitter monoamine ini. Hasil ini konsisten dengan laporan penyelidikan yang diterbitkan lebih awal mengenaiCistancheekstrak memodulasi neurotransmiter monoamine otak.

Ujian biomarker biokimia selanjutnya mendedahkan bahawa CUMS mendorong peningkatan teguh berbilang sitokin pro-radang (TNF‑, IL‑1, IL‑18, IL‑6, IFN‑ ) serta mediator keradangan (iNOS, COX‑2, PGE2) dalam tisu hippocampal. Campur tangan CPhG secara ketara membalikkan status ekspresi berlebihan keradangan tersebut. Pewarnaan HE dan Nissl histopatologi secara intuitif membuktikan CPhG mengurangkan tekanan yang menyebabkan kerosakan neuron hippocampal dan integriti morfologi neuron dilindungi.

Populasi sel glial berfungsi sebagai peserta pusat yang mengantara tindak balas neuro-radang. Astrocytes mengekalkan kitar semula neurotransmitter, kestabilan struktur penghalang darah-otak dan bekalan nutrisi neuron. Mikroglia berfungsi sebagai sel efektor imun semula jadi yang menetap di dalam parenkim otak. Tekanan kronik mencetuskan kehilangan astrosit atau ketidakcekapan berfungsi, di samping pengaktifan hiper-patologi mikroglia. Data imunohistokimia kami menunjukkan bahawa rawatan CPhGs meningkatkan ketumpatan astrocyte positif GFAP, sementara itu menurunkan kuantiti mikroglia terlampau diaktifkan Iba-1 dalam hippocampus. Sifat pengawalseliaan sel glial-fenotip ini mungkin sebahagiannya mendasari potensi farmakologi pelindung saraf dan anti-kemurungan CPhG.

Inflammasom NLRP3 mewakili platform molekul penting yang mengantarkan lata neuro-radang. Pengaktifannya memacu pematangan dan rembesan sitokin pro-radang IL-1 dan IL-18 hiliran. Paksi isyarat TLR4/NF‑κB bertindak sebagai isyarat penyebuan huluan penting untuk pengaktifan inflammasom NLRP3. Rangsangan reseptor TLR4 menggalakkan fosforilasi subunit NF‑κB dan translokasi nuklear, seterusnya trans-mengaktifkan transkripsi gen NLRP3, pro‑IL‑1. Dalam kajian kami sekarang, tekanan CUMS mencetuskan peningkatan serentak untuk TLR4, ekspresi protein NF‑κB p65, NLRP3 dan Caspase‑1 terfosforilasi. Campur tangan CPhG dengan jelas menghalang pengaktifan keseluruhan lata isyarat ini. Oleh itu, kami menyimpulkan bahawa CPhGs mengurangkan kecederaan neuro-radang sebahagiannya dengan menghalang pengaktifan inflammasom NLRP3 yang dimediasi TLR4/NF‑κB.

Secara keseluruhannya, bukti eksperimen model haiwan kami menyokong model mekanistik: CPhG menjana kesan seperti antidepresan dalam tikus kemurungan yang disebabkan oleh CUMS melalui dua dimensi utama: (1) memulihkan homeostasis neurotransmitter monoamine yang berkaitan dengan mood (5-HT, DA); (2) memodulasi homeostasis sel glial hippocampal dan menindas TLR4/NF‑κB-driven NLRP3 inflammasome-dependent neuro-inflammatory lata patologi.

Beberapa batasan penyiasatan ini wajar dipertimbangkan. Kerja ini semata-mata melaksanakan eksperimen in-vivo peringkat haiwan. Kami tidak menjalankan pengesahan mekanistik peringkat selular mahupun ujian klinikal manusia. Oleh itu, inferens translasi terhadap terapi kemurungan manusia harus kekal berhemat. Selain itu, penyelidikan ini tidak membedah sumbangan sebatian monomer individu (echinacoside, verbascoside) dalam ekstrak campuran CPhGs. Penyelidikan masa depan mungkin menumpukan pada pengesahan mekanistik kultur sel, perbandingan aktiviti komponen individu, serta pemerhatian perintis subjek manusia awal.

5. Kesimpulan

Cistanche phenylethanol glycosides (CPhGs) menghasilkan tindakan farmakologi seperti antidepresan yang ketara terhadap fenotip tingkah laku seperti kemurungan ringan yang tidak dapat diramalkan dalam C57BL/6 tikus. Mekanisme berkaitan terapeutiknya dikaitkan dengan pemulihan tahap serotonin serum dan hippocampal dan neurotransmitter dopamin, pemeliharaan integriti struktur neuron hippocampal, modulasi keseimbangan fungsi astrocyte-microglia, serta penindasan TLR4/NF‑κB/NLRP3 inflammasom-mediated pathological neurocascade. Kajian haiwan pra-klinikal ini membekalkan rujukan eksperimen untuk pembangunan lanjut CPhG sebagai bahan pembantu terapeutik semula jadi atau bahan makanan berfungsi yang menyasarkan penambahbaikan gejala kemurungan.

Rujukan

Ren L, Shao YT, Qin SH. Kajian tentang pengenalpastian sasaran dan kesan saponin A terhadap gangguan kemurungan. Nat Prod Res Dev, 2024, 36:44‑51.

Fan L, Peng Y, Wang JW, et al. Jumlah glikosida daripada batang Cistanche tubulosa mengurangkan tingkah laku seperti kemurungan: interaksi dua arah bagi fitokimia dan mikrobiota usus. Phytomedicine, 2021, 83:153471.

Fan L, Peng Y, Chen XN, et al. Analisis bersepadu komposisi fitokimia, farmakokinetik dan farmakologi rangkaian untuk menyelidik perbezaan antara batang Cistanche deserticola dan C. tubulosa berdasarkan aktiviti antidepresan. Makanan & Fungsi, 2022,13:8542‑8557.

Yirmiya R, Rimmerman N, Reshef R. Kemurungan sebagai penyakit mikroglial. Trend dalam Neurosains, 2015, 38:637‑658.

Jia XN, Gao ZH, Hu HL. Microglia dalam kemurungan: perspektif semasa. Science China‑Life Sciences, 2021, 64:911‑925.

Wu B, Gan AN, Wang RX, et al. Alpinia oxyphylla Miq. minyak meruap memperbaiki tingkah laku kemurungan dan menghalang keradangan saraf dalam tikus yang terdedah CUMS dengan menghalang laluan isyarat MyD88/NF‑κB yang dimediasi TLR4. Jurnal Neuroanatomi Kimia, 2023,130:102270.