Abstrak

Cistanche tubulosa(Schenk) Wight, herba homolog perubatan makanan berharga daripada keluarga Orobanchaceae, ditanam secara meluas di selatan Xinjiang, China. Konstituen glikosida phenylethanoid bioaktif utamanya,echinacosidedanacteoside (verbascoside), menyampaikan pelbagai aktiviti farmakologi termasuk anti-pengoksidaan, anti-keradangan dan pengawalan imun. Prosedur pemprosesan tradisional yang tidak piawai sering menyebabkan kehilangan besar sebatian aktif teras ini, mengehadkan penggunaan ubat dan makanan berfungsiCistanche tubulosapotongan rebusan. Penyelidikan ini bertujuan untuk mengoptimumkan parameter pemprosesan moden untuk segarCistanche tubulosahirisan untuk memaksimumkan pemulihan acteoside dan echinacoside, dan seterusnya menjelaskan bioaktiviti anti-oksidatif-tekanan dan anti-radang serta mekanisme molekul asas kepingan merebus yang diproses secara optimum pada tahap selular.

Eksperimen faktor tunggal telah dilakukan untuk menyaring julat yang sesuai untuk ketebalan kepingan, tempoh mengukus dan suhu pengeringan ketuhar. Metodologi permukaan tindak balas tiga faktor tiga peringkat Box‑Behnken telah diterima pakai untuk mewujudkan model interaksi berbilang faktor, menggunakan kandungan acteoside dan echinacoside sebagai penunjuk penilaian dwi. Selepas itu, model sel makrofaj tikus RAW264.7 yang dirangsang lipopolysaccharide (LPS) telah dibina untuk mensimulasikan peroksidasi lipid dan kerosakan keradangan akut. Satu siri ujian biokimia termasuk MTT, pengesanan pendarfluor ROS, ELISA dan Western blot telah dilaksanakan untuk menilai potensi tekanan anti-oksidatif dan meneroka laluan transduksi isyarat.

Mengikut keputusan eksperimen, parameter pemprosesan optimum ditentukan sebagai ketebalan kepingan 0.6 cm, rawatan mengukus selama 6 minit, dan suhu pengeringan ditetapkan kepada 57 darjah . Di bawah keadaan pemprosesan praktikal ini, kandungan terukur acteoside dan echinacoside masing-masing mencapai 7.25 % dan 31.62 %, menunjukkan ketekalan yang baik dengan nilai ramalan teori. Ujian berasaskan sel mendedahkan bahawa diproses secara optimumCistanche tubulosaekstrak rebusan telah mengurangkan kepekatan oksida nitrat (NO) dan malondialdehid (MDA) dengan ketara dalam makrofaj RAW264.7 yang dicabar LPS. Sementara itu, ia meningkatkan aktiviti enzim antioksidan intraselular superoksida dismutase (SOD), katalase (CAT), laktat dehidrogenase (LDH), bersama-sama dengan peningkatan kandungan glutation (GSH). Tahap rembesan mediator pro-radang termasuk TNF‑, IL‑1 dan IL‑6 juga ditindas dalam cara yang bergantung kepada dos. Pengesanan Western‑blot mengesahkannyaCistanche tubulosaekstrak menghalang fosforilasi berlebihan protein utama dalam lata isyarat p38/AKT/JNK/NF‑κB.

Ringkasnya, protokol pemprosesan moden yang dioptimumkan ini secara berkesan meningkatkan hasil glikosida fenilethanoid berciri (acteoside dan echinacoside) dalamCistanche tubulosapotongan rebusan. Bahan herba yang diproses memberikan kesan anti-oksidatif-tekanan dan anti-radang yang ketara dalam model kecederaan makrofaj yang disebabkan oleh LPS, yang mekanisme farmakologinya sebahagiannya direalisasikan melalui menghalang pengaktifan berlebihan paksi isyarat radang p38/AKT/JNK/NF‑κB. Kerja ini menyediakan parameter teknikal yang boleh dipercayai untuk pembuatan perindustrian piawai dan membekalkan sokongan eksperimen untuk membangunkan makanan berfungsi anti-oksidan yang diperoleh daripadaCistanche tubulosa.

Kata kunci: Cistanche tubulosa; teknologi pemprosesan rebusan; acteoside; echinacoside; tekanan anti-oksidatif; RAW264.7 makrofaj; Laluan isyarat p38/AKT/JNK/NF‑κB

1. Pengenalan

Cistanche tubulosa(Schenk) Wight tergolong dalam keluarga Orobanchaceae, dan batang bersisik berisi adalah bahagian perubatan rasmi. Tumbuhan ubatan padang pasir ini banyak ditanam di selatan Xinjiang, China yang gersang. Dalam amalan herba tradisional Cina,Cistanche tubulosaberfungsi sebagai herba tonik klasik dengan fungsi terapeutik yang didokumenkan untuk menguatkan buah pinggang-yang, menambah darah pati dan melegakan pergerakan usus. Secara klinikal ia digunakan untuk melegakan kesakitan‑kelemahan lumbus dan lutut, ketidaksuburan yang disebabkan oleh kekurangan buah pinggang, dan kekeringan usus yang disebabkan oleh sembelit维普期刊.

Glikosida phenylethanoid bermaksud penanda bioaktif yang paling kritikal bagiCistanche tubulosa. The Chinese Pharmacopoeia menetapkan bahawa jumlah kandungan echinacoside plus acteoside tidak boleh kurang daripada 1.50 % untuk bahan perubatan yang layak. Namun begitu, pembuatan arus perdana semasaCistanche tubulosakepingan rebusan masih kebanyakannya mengikut aliran kerja manual kuno: merendam herba mentah segar, membasahkan dengan teliti, menghiris dan pengeringan semula jadi atau pemprosesan mengukus wain. Pendekatan konvensional ini tidak mempunyai spesifikasi teknikal kuantitatif yang tepat. Ketidakstabilan terma glikosida phenylethanoid selalunya membawa kepada degradasi bahan aktif yang teruk semasa pemprosesan, yang merendahkan kualiti produk akhir dan menyekat pengeluaran berkualiti tinggi berskala besar. Pada masa ini, hanya penyelidikan terhad secara serentak menggabungkan pengoptimuman teknologi pemprosesan dengan pengesahan aktiviti biologi; kebanyakan kajian hanya mengesan kandungan konstituen kimia tanpa pengesahan fungsi selular, mewujudkan jurang untuk transformasi industriGoogle untuk....

Tekanan oksidatif bertindak sebagai pencetus patologi teras untuk pelbagai penyakit metabolik dan keradangan kronik. Pengumpulan spesies reaktif-oksigen (ROS) yang berlebihan mengganggu homeostasis redoks, seterusnya mencetuskan pengaktifan berlebihan makrofaj dan pembebasan sitokin pro-radang yang besar-besaran, membentuk kitaran ganas antara pengoksidaan dan keradangan. Penyiasatan farmakologi sedia ada telah membuktikannyaCistanche‑asal phenylethanoid glycosides mempunyai sifat antioksidan dan anti-radang. Eksperimen haiwan sebelumnya menunjukkan ituCistanche tubulosajumlah glikosida memperbaiki kecederaan hepatik dalam model tikus sepsis dengan mengaktifkan isyarat antioksidan Nrf2/HO‑1. Komponen lignan-glikosida diasingkan daripadaCistanche tubulosaboleh mengurangkan tindak balas keradangan yang dibangkitkan oleh LPS melalui modulasi laluan PI3K/AKT dalam makrofaj RAW264.7. Walau bagaimanapun, sama ada bahagian rebusan yang dihasilkan di bawah keadaan pemprosesan yang baru dioptimumkan mengekalkan bioaktiviti tekanan anti-oksidatif yang kuat belum dinilai secara sistematik. Mekanisme pengawalseliaan molekul konkrit masih memerlukan penerokaan yang lebih mendalam.

Makrofaj RAW264.7 yang dirangsang LPS ialah model kerosakan keradangan-oksidatif-in-vitro yang diterima baik, diterima pakai secara meluas untuk menilai kesan anti-oksidan dan anti-radang produk semula jadi. Dalam kajian ini, kami mula-mula menjalankan saringan faktor tunggal diikuti dengan pengoptimuman permukaan tindak balas Box‑Behnken untuk mendapatkan parameter teknikal penghirisan‑pengukusan‑pengeringan piawai yang menyasarkan hasil acteoside dan echinacoside yang tinggi. Selepas memperoleh produk rebusan yang dioptimumkan, kami menyediakan ekstrak herba dan mengguna pakai model kecederaan selular RAW264.7 yang disebabkan oleh LPS. Pelbagai platform eksperimen termasuk pengukuran penanda oksidatif-tekanan-biokimia, kuantifikasi ELISA sitokin dan analisis laluan Western-blot digunakan untuk menjelaskan keberkesanan anti-oksidatif-tekanan dan mekanisme transduksi isyarat. Penyelidikan ini menyampaikan parameter proses praktikal untuk pengeluaran skala perintis berkualiti tinggiCistanche tubulosakepingan rebusan dengan aktiviti tekanan anti-oksidatif yang stabil, dan meletakkan asas eksperimen untuk pembangunan seterusnya produk makanan berfungsi dan makanan tambahan yang diperoleh daripada XinjiangCistanche tubulosasumber.

2. Bahan dan Kaedah

2.1 Bahan Mentah, Reagen dan Instrumen

SegarCistanche tubulosabatang berdaging dituai pada musim luruh dari Hotan, Wilayah Autonomi Uyghur Xinjiang, China. Barisan sel leukemia monosit-makrofaj tikus RAW264.7 telah dibeli daripada Procell Life Science & Technology Co., Ltd (Wuhan, China). Acetonitril gred kromatografi dan metanol dibekalkan oleh Merck (Jerman). Bahan piawai rujukan echinacoside dan acteoside (ketulenan Lebih daripada atau sama dengan 98 %) diperolehi daripada Institut Penyelidikan Teknologi Metrologi Weiye Utara Beijing. Dimetil sulfoksida (DMSO) dibeli daripada Sigma‑VETEC (AS). Medium glukosa tinggi DMEM, kit ujian total protein BCA adalah produk Thermo Fisher Scientific (USA). Fetal bovine serum (FBS) dibeli daripada BI (Israel). Larutan antibodi berganda penicillin-streptomycin berasal dari HyClone (AS). Kit ujian komersial untuk NO, MDA, SOD, CAT, GSH telah diperoleh daripada Beyotime Biotechnology (Shanghai, China). Kit pengesanan LDH dan lipopolisakarida (LPS,E. coli055:B5) diperoleh daripada Solarbio (Beijing, China).

Instrumen makmal utama termasuk sistem kromatografi cecair (HPLC) berprestasi tinggi Shimadzu, penyejat berputar LabTech, penumbuk herba Cina berkelajuan tinggi jenis swing, ketuhar pengeringan letupan termostatik, peralatan periuk stim, BioTek SYNERGY‑H1 multi-plate4N, pembaca mikroplatetik FA1204N. Empar peti sejuk CF1524R, kabinet biokeselamatan BSC‑1300IIA2 dan mikroskop optik terbalik BDS200‑PH.

2.2 Eksperimen Pemprosesan Faktor Tunggal

SegarCistanche tubulosabatang berdaging dipotong menjadi kepingan dengan ketebalan yang berbeza (0.2 cm, 0.4 cm, 0.6 cm, 0.8 cm, 1.0 cm, 1.2 cm). Kepingan dikukus untuk tempoh yang berbeza-beza (3 min, 6 min, 9 min, 12 min, 15 min, 18 min, 21 min). Selepas itu bahan dikeringkan di bawah kecerunan suhu yang berbeza (ambien 25 darjah, 40 darjah, 50 darjah, 60 darjah, 70 darjah, 80 darjah). Sampel rebusan yang telah kering sepenuhnya telah dihancurkan dan diayak melalui ayak 40-mesh untuk kuantiti komponen HPLC yang berikutnya.

2.3 Penentuan Kandungan Acteoside dan Echinacoside

Penyediaan sampel-larutan: Timbang dengan tepat 1.0 g serbuk rebusan yang dilumatkan ke dalam kelalang kon bersumbat. Tambah 100 mL larutan metanol 50% dengan tepat. Lakukan rendaman selama 30 minit diikuti dengan pengekstrakan ultrasonik selama 40 minit. Selepas menyejukkan, tambahkan pelarut penurunan berat badan dengan 50 % metanol, gaul rata dan benarkan penyelesaian statik. Supernatan ditapis melalui membran mikroporous 0.22 μm untuk suntikan HPLC.

Penyediaan larutan piawai rujukan: Timbang kuantiti bahan rujukan acteoside dan echinacoside yang sesuai dengan tepat, larutkan dengan 50 % metanol di dalam kelalang volumetrik, sediakan larutan piawai kecerunan bersiri, tapis dengan membran penapis 0.22 μm.

Persediaan kromatografi: lajur analitik COSMOSIL C₁₈; sistem fasa mudah alih: fasa mudah alih A: 0.1 % larutan akueus asid fosforik; fasa mudah alih B: asetonitril. Panjang gelombang pengesanan ditetapkan sebagai 330 nm; suhu lajur 35 darjah; kadar aliran 1 mL/min. Kaedah standard luaran telah digunakan untuk pengiraan kuantitatif kandungan acteoside dan echinacoside. Skor penilaian menyeluruh=(kandungan echinacoside × 50 %) + (kandungan acteoside × 50 %). Skor komprehensif berfungsi sebagai penunjuk penilaian komposit untuk prestasi keadaan pemprosesan.

2.4 Reka Bentuk Eksperimen Permukaan Box‑Behnken Response‑Surface

Berdasarkan hasil percubaan faktor tunggal, perisian Design‑Expert 13.0 telah digunakan untuk melaksanakan susunan percubaan tiga faktor tiga peringkat Box-Behnken. Ketebalan kepingan (X₁, cm), masa rawatan mengukus (X₂, min), suhu pengeringan (X₃, darjah ) dipilih sebagai pembolehubah bebas. Kandungan acteoside (Y₁, %) dan kandungan echinacoside (Y₂, %) ialah nilai tindak balas. Tujuh belas kumpulan eksperimen telah dijalankan. Tahap sifar untuk setiap faktor telah dipilih mengikut parameter optimum yang diperoleh dalam ujian faktor tunggal. Selepas menamatkan ujian permukaan tindak balas, analisis varians model, plot permukaan tindak balas 3D dan ramalan keadaan telah selesai. Eksperimen pengesahan praktikal telah dijalankan selepas melaraskan parameter ramalan teori kepada nilai pengeluaran sebenar yang boleh dikendalikan.

2.5 Kultur Sel dan Penyediaan Sampel

Bahan mentah rebusan telah dihasilkan di bawah keadaan pemprosesan yang optimum. Serbuk herba telah diekstrak mengikut protokol penyediaan sampel yang disebutkan di atas, dipekatkan oleh penyejatan berputar dan dikeringkan dengan vakum untuk mendapatkan serbuk ekstrak pepejal. Penyelesaian stok disediakan dengan melarutkan serbuk ekstrak dalam DMSO, selanjutnya dicairkan dengan medium DMEM lengkap (mengandungi 10 % FBS dan 1 % penisilin-streptomycin) untuk eksperimen selular; kepekatan kerja DMSO akhir dikawal di bawah 0.1 % (v/v). Makrofaj RAW264.7 telah dibiakkan dalam medium lengkap DMEM di bawah 37 darjah, persekitaran inkubator lembap 5% CO₂.

2.6 Ujian Sitotoksisiti MTT

Sel RAW264.7 telah disemai ke atas plat mikro 96-telaga pada ketumpatan sel 8 × 10⁴ sel/mL. Kumpulan eksperimen termasuk kumpulan kawalan pelarut (0.1 % medium DMSO), kumpulan model LPS (kepekatan LPS akhir 1 ug/mL), dan berbilangCistanche tubulosakumpulan kepekatan ekstrak (3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400 ug/mL). Selepas 2-jam pra-inkubasi dengan sampel herba, LPS (1 ug/mL kepekatan akhir) telah ditambah kepada setiap kumpulan kecuali kumpulan kawalan pelarut. Pengeraman diteruskan selama 24 jam. Kemudian reagen MTT (5 mg/mL) ditambah dan diinkubasi selama 4 jam. Buang supernatan, tambah 150 μL DMSO setiap perigi, goncang pada 37 darjah selama 15 minit. Nilai penyerapan pada panjang gelombang 490 nm dibaca pada pembaca plat mikro, dan kadar kemandirian sel dikira. Julat kepekatan kerja yang selamat telah ditentukan untuk ujian fungsi susulan.

2.7 Pengukuran ROS Intraselular

Makrofaj RAW264.7 telah diinokulasi pada plat enam telaga pada ketumpatan 4 × 10⁵ sel setiap telaga. Selepas pematuhan sel, rawatan pengelompokan dilakukan: kumpulan kawalan pelarut, kumpulan model LPS, dan kumpulan rawatan ekstrak CT (12.5, 25, 50, 100 ug/mL). Selepas 2 jam pra-rawatan dengan sampel, LPS 1 ug/mL ditambah kecuali kumpulan kawalan pelarut, mengeram 24 jam. Tahap ROS intraselular telah dikesan menggunakan kaedah pemuatan kuar pendarfluor mengikut arahan kit. Keamatan pendarfluor diukur dengan pembaca plat mikro pendarfluor (pengujaan 488 nm, pelepasan 525 nm).

2.8 Pengesanan NO, MDA, SOD, CAT, LDH dan GSH

Selepas rawatan sel yang sepadan, supernatan kultur sel dikumpul untuk pengukuran NO yang menggunakan tindak balas Griess. Sel-sel yang dilekatkan telah dibasuh dengan PBS yang telah disejukkan sebelumnya, dilisiskan pada ais, supernatan lisat sel dituai selepas pengemparan (10 000 r/min, 4 darjah, 5 min). Kit BCA menentukan jumlah kepekatan protein bagi setiap sampel. Kandungan penunjuk aktiviti MDA, GSH dan enzim SOD, CAT, LDH telah diuji dengan ketat mengikut manual operasi kit.

2.9 Penentuan ELISA Sitokin Pro-Inflamasi

Sel RAW264.7 menerima sampel pra-rawatan dan rangsangan LPS untuk jumlah 16 jam. Supernatan kultur sel dikumpul dan disentrifugasi. Kepekatan TNF‑, IL‑1, IL‑6 dalam supernatan dikira oleh kit ELISA komersial.

2.10 Analisis Western-Blot

Selepas 45 minit LPS dan inkubasi bersama sampel, sel RAW264.7 telah dilisiskan menggunakan penimbal lisis RIPA yang ditambah dengan koktel perencat protease-phosphatase. Lisat sel telah disentrifugasi pada 10 000 r/min di bawah 4 darjah selama 5 minit. Kit BCA mengukur kepekatan total protein. Protein sampel (50 ug setiap lorong) telah didenaturasi pada mandi logam 100 darjah selama 5 minit. Elektroforesis gel SDS‑PAGE memisahkan protein sasaran, yang kemudiannya dipindahkan ke membran PVDF. Membran disekat selama 1 jam dengan larutan TBST susu skim 5%. Antibodi utama yang menyasarkan p38, p‑p38, AKT, p‑AKT, JNK, p‑JNK, NF‑κB p65, p‑NF‑κB p65 dan GAPDH diinkubasi semalaman pada 4 darjah . Selepas mencuci TBST, antibodi sekunder yang sepadan diinkubasi pada suhu bilik selama 1 jam. Selepas mencuci berulang kali, reagen chemiluminescent ultra-sensitif ECL digunakan untuk pengimejan jalur protein. Analisis kuantitatif skala kelabu jalur telah dilaksanakan untuk menilai tahap ekspresi protein fosforilasi relatif.

2.11 Analisis Statistik

Perisian GraphPad Prism 8.0.2 telah digunakan untuk pengiraan statistik dan plot graf. Keputusan data kuantitatif eksperimen dinyatakan sebagai min ± sisihan piawai (\\(\\bar{x} \\pm s\\)). ANOVA sehala diikuti dengan ujian perbandingan berbilang post-hoc telah digunakan untuk perbandingan antara kumpulan. \\(Hlm<0.05\) represented statistically significant difference; \(P<0.01\) highly significant difference; \(P<0.001\) extremely significant difference.

3. Keputusan Eksperimen

3.1 Hasil Eksperimen Faktor Tunggal

Slice thickness exerted obvious influence over the contents of acteoside and echinacoside. Slices at 0.2 cm thickness were easily over‑steamed, leading to thermal degradation of phenylethanoid‑glycoside active components. Excessively thick slices (>0.4 cm) menghalang pembebasan bahan dalaman, menurunkan kandungan komponen akhir yang boleh dikesan. Di bawah masa pengukusan tetap (10 minit) dan suhu pengeringan (60 darjah), ketebalan kepingan 0.4 cm mencapai skor penilaian komprehensif tertinggi.

Keputusan tempoh rawatan mengukus: apabila ketebalan kepingan ditetapkan kepada 0.4 cm dan suhu pengeringan dikekalkan pada 60 darjah, masa mengukus yang tidak mencukupi tidak dapat memusnahkan struktur sel tumbuhan dengan secukupnya sehingga sebatian aktif sukar dibubarkan. Apabila masa mengukus melebihi 6 minit, mengukus berlebihan tisu herba rosak dan menyebabkan degradasi echinacoside dan acteoside. Oleh itu 6 minit dikenal pasti sebagai tempoh pemprosesan pengukusan yang lebih baik.

Untuk eksperimen kecerunan suhu pengeringan ketuhar: ketebalan kepingan 0.4 cm dan masa mengukus 6 minit telah ditetapkan. Kandungan komponen meningkat dengan peningkatan suhu pengeringan dalam julat tertentu. Setelah suhu pengeringan melepasi 60 darjah, penguraian terma suhu tinggi menyebabkan penurunan ketara kandungan bahan sasaran. Oleh itu 60 darjah dipilih sebagai keadaan suhu pengeringan optimum awal untuk pengoptimuman permukaan tindak balas seterusnya.

3.2 Pengoptimuman dan Pengesahan Permukaan Box‑Behnken Response‑Surface

Tujuh belas kumpulan larian eksperimen Box‑Behnken telah selesai mengikut matriks reka bentuk. Keputusan analisis varians menunjukkan bahawa model regresi untuk kedua-dua kandungan acteoside dan echinacoside mencapai kepentingan statistik (\\(P<0.05\)). The lack‑of‑fit terms were non‑significant (\(P>0.05\)), demonstrating satisfactory model‑fitting quality. Coefficient of determination \(R^2\) values were close to 1, illustrating high consistency between predicted values and practical measured experimental data. Factor‑influence rank for acteoside yield: slice thickness > drying temperature > steaming time. Factor‑influence rank for echinacoside yield: steaming time > drying temperature >ketebalan kepingan.

Melalui pengiraan matematik model, parameter pemprosesan optimum teori ialah: ketebalan kepingan 0.600 cm, masa rawatan mengukus 5.685 min, suhu pengeringan 57.009 darjah . Mengambil kira kebolehlaksanaan operasi industri sebenar, parameter telah dilaraskan kepada ketebalan kepingan 0.6 cm, masa mengukus 6 minit, suhu pengeringan 57 darjah . Tiga eksperimen pengesahan selari telah dilakukan. Di bawah keadaan praktikal ini, kandungan acteoside yang diukur ialah 7.25 %, kandungan echinacoside mencapai 31.62 %. Sisihan antara nilai yang diukur dan ramalan teori kekal di bawah 5%, membuktikan bahawa model permukaan tindak balas ini boleh dipercayai dan boleh digunakan untuk membimbing pengeluaran rebusan dunia sebenar.

3.3 Pemeriksaan Sitotoksisiti bagi Diproses DioptimumkanCistanche tubulosaEkstrak dalam Sel RAW264.7

Keputusan sitotoksisiti MTT mendedahkan bahawa kepekatan ekstrak antara 0-100 ug/mL tidak memberikan kesan toksik yang jelas pada makrofaj RAW264.7, malah menunjukkan kecenderungan menggalakkan pembiakan sel yang ringan. Apabila kepekatan rawatan meningkat kepada 200 ug/mL dan 400 ug/mL, kadar kemandirian sel menurun dengan ketara berbanding kumpulan kawalan pelarut, menunjukkan sitotoksisiti bergantung kepada kepekatan. Oleh itu, kecerunan kepekatan 12.5 ug/mL, 25 ug/mL, 50 ug/mL, 100 ug/mL telah dipilih sebagai kepekatan kerja yang selamat untuk ujian selular yang berkaitan dengan tekanan oksidatif dan keradangan.

3.4 Cistanche tubulosaEkstrak Tahap ROS Intraselular yang Dikurangkan dalam Makrofaj Terransang LPS

Berbanding dengan kumpulan kawalan pelarut, keamatan pendarfluor ROS intraselular kumpulan model LPS meningkat dengan sangat ketara (\\(P<0.001\)), confirming successful construction of cellular oxidative‑damage model. After intervention with gradient‑concentration Cistanche tubulosaekstrak, pengumpulan ROS intraselular merosot dalam cara yang bergantung kepada dos. Setiap kumpulan rawatan ubat menunjukkan pengurangan ROS yang ketara secara statistik berbanding kumpulan model LPS (\\(P<0.001\)). This finding demonstrated that processed‑herb extract could effectively restrain excess ROS generation under inflammatory stimulation.

3.5 Kesan pada Kandungan NO dan MDA

NO berfungsi sebagai mediator radang klasik yang dikeluarkan oleh makrofaj yang diaktifkan. MDA ialah biomarker piawai emas yang mencerminkan kecederaan oksidatif peroksidasi lipid. Berbanding dengan kumpulan kawalan pelarut, rangsangan LPS dengan ketara meningkatkan kandungan NO dan MDA dalam sel RAW264.7 (\\(P<0.001\)). Different dosages of Cistanche tubulosarawatan ekstrak boleh menurunkan kepekatan NO dengan ketara. Untuk penunjuk MDA: kumpulan 12.5 ug/mL tidak menghasilkan peningkatan yang ketara secara statistik; Kumpulan kepekatan 25-100 ug/mL secara ketara menurunkan tahap MDA (\\(P<0.001\)). The results illustrated that extracts alleviated LPS‑triggered lipid‑peroxidation injury and inflammatory‑mediator over‑production.

3.6 Kesan ke atas Penunjuk Biokimia Berkaitan Antioksidan SOD, CAT, LDH, GSH

Selepas cabaran LPS, aktiviti enzimatik SOD, CAT, LDH intraselular serta kandungan GSH menurun secara mendadak berbanding kumpulan kawalan pelarut (\\(P<0.001\)). Low‑dose (12.5 μg/mL) extract treatment could significantly raise SOD activity, but failed to generate prominent changes for CAT and LDH activity. Medium‑and‑high concentration groups (25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL) concentration‑dependently enhanced SOD, CAT, LDH enzyme activities and intracellular GSH content (\(P<0.001\)). It indicated that optimally‑processed Cistanche tubulosaekstrak rebusan boleh memulihkan kapasiti pertahanan anti-oksidan endogen selular terhadap penghinaan oksidatif yang disebabkan oleh LPS.

3.7 Kesan Perencatan pada Sitokin Pro‑Radang TNF‑, IL‑1, IL‑6 Pelepasan

Keputusan pengesanan ELISA menunjukkan bahawa rangsangan LPS sangat menggalakkan rembesan TNF‑, IL‑1, IL‑6 daripada makrofaj RAW264.7 (\\(P<0.001\)). With the increase of Cistanche tubulosakepekatan rawatan ekstrak, kuantiti pelepasan tiga sitokin pro-radang utama ini telah ditindas secara berperingkat, menunjukkan korelasi tindak balas dos yang jelas. Ia mengesahkan bahawa ekstrak herba mempunyai fungsi anti-radang yang kuat dengan menghalang rembesan pro-radang-sitokin daripada makrofaj yang diaktifkan.

3.8 Peraturan pada p38/AKT/JNK/NF‑κB Laluan Isyarat Fosforilasi

Data percubaan Western-blot menunjukkan bahawa nisbah p‑p38/p38, p‑AKT/AKT, p‑JNK/JNK dan p‑NF‑κB/NF‑κB telah meningkat dengan ketara dalam kumpulan model LPS berbanding kumpulan kawalan pelarut (\\(P<0.001\)). Medium‑and‑high‑dosage Cistanche tubulosacampur tangan ekstrak telah menurunkan nisbah p‑p38/p38 dan p‑JNK/JNK dengan ketara (\\(P<0.001\)). All concentration‑treatment groups obviously down‑regulated p‑AKT/AKT and p‑NF‑κB/NF‑κB phosphorylation level (\(P<0.05\) or \(P<0.001\)). These observations proved that Cistanche tubulosaekstrak sekeping merebus melegakan kecederaan oksidatif-radang melalui penindasan pengaktifan hiper-fosforilasi rangkaian isyarat p38/AKT/JNK/NF‑κB.

4. Perbincangan

Keperluan pemprosesan tradisional yang direkodkan dalam Farmakope Cina untukCistanche tubulosaterutamanya termasuk penyingkiran bendasing, mencuci, melembapkan, menghiris dan mengeringkan, tanpa menyatakan parameter berangka yang tepat untuk ketebalan kepingan, tempoh mengukus dan suhu pengeringan. Pemprosesan manual bukan standard membawa turun naik kualiti besar produk rebusan komersial. Glikosida phenylethanoid (echinacoside dan acteoside) ialah sebatian bioaktif yang tidak tahan haba. Masa atau suhu pemanasan yang tidak betul akan mencetuskan penguraian kimia dan mengurangkan nilai perubatan. Eksperimen faktor tunggal kami mendedahkan bahawa pengukusan yang tidak mencukupi dan berlebihan serta suhu pengeringan yang terlalu tinggi akan menyebabkan kehilangan komponen glikosida sasaran. Pengoptimuman berbilang faktor Box‑Behnken selanjutnya memperoleh parameter pembuatan praktikal: ketebalan kepingan 0.6 cm, mengukus 6 minit, pengeringan 57 darjah . Di bawah keadaan ini, kandungan acteoside dan echinacoside mencapai 7.25% dan 31.62%, jauh melebihi ambang kualiti minimum farmakope. Protokol yang dioptimumkan ini menyediakan rujukan teknikal kuantitatif yang boleh dilaksanakan untuk pemprosesan industri piawai asal XinjiangCistanche tubulosa.

Tekanan oksidatif dan keradangan adalah proses patologi yang saling berkait rapat. ROS berlebihan mendorong peroksidasi lipid dan menjana MDA, yang seterusnya mengaktifkan makrofaj imun semula jadi. Makrofaj yang diaktifkan merembeskan NO yang banyak dan pelbagai sitokin pro-radang, yang sebaliknya menguatkan pengeluaran ROS intraselular, membentuk kitaran ganas oksidatif-radang yang menguatkan sendiri. Bahan anti-oksidan terbitan tumbuhan semula jadi boleh memecahkan gelung patologi ini dengan meningkatkan sistem enzim anti-oksida endogen dan menghalang transduksi isyarat keradangan. Dalam kajian in‑vitro ini, diproses secara optimumCistanche tubulosaekstrak rebusan merendahkan tahap ROS, NO dan MDA, sambil meningkatkan aktiviti SOD, CAT, LDH dan kandungan GSH dalam makrofaj RAW264.7 yang dirangsang LPS. Pada masa yang sama, ia menghalang rembesan TNF‑, IL‑1, IL‑6 pro-inflamasi‑sitokin, menunjukkan kapasiti anti-oksidatif-tekanan dan anti-radang bersepadu.

Molekul keluarga protein-kinase yang diaktifkan mitogen p38, JNK bersama-sama dengan AKT dan NF‑κB menyusun hab transduksi isyarat pusat yang mengantara tindak balas inflamasi-oksidatif makrofaj. Apabila rangsangan LPS, isyarat hulu mencetuskan pengaktifan fosforilasi p38, JNK dan AKT, yang secara berurutan menggalakkan fosforilasi subunit NF‑κB p65 dan translokasi nuklear. NF‑κB yang diaktifkan bertindak sebagai faktor transkripsi dan memulakan transkripsi kumpulan besar gen pro-radang-sitokin dan oksidatif-tekanan. Keputusan Western‑blot kami menunjukkannyaCistanche tubulosaekstrak boleh menyekat fosforilasi p38, JNK, AKT dan NF‑κB p65. Oleh itu, kami membuat kesimpulan bahawa aktiviti bio-tekanan anti-oksidatif dan anti-radang dicapai, sekurang-kurangnya sebahagiannya, melalui menyekat lebihan pengaktifan paksi isyarat p38/AKT/JNK/NF‑κB.

Terdapat beberapa batasan dalam penyelidikan semasa. Semua pengesahan berfungsi terhad kepada tahap kultur sel in‑vitro. Eksperimen in-vivo model haiwan selanjutnya diperlukan untuk mengesahkan prestasi farmakodinamik in-vivo bagi kepingan rebusan yang dioptimumkan. Di samping itu, kajian ini menggunakan jumlah ekstrak campuran daripada kepingan merebus, jadi kita tidak dapat membezakan sumbangan individu echinacoside, acteoside dan metabolit sekunder kecil yang lain. Penyelidikan susulan boleh mengasingkan sebatian monomer untuk membandingkan potensi tekanan anti-oksidatif masing-masing, dan menjalankan penyiasatan kesan keserasian. Walaupun begitu, kerja kami sekarang masih memberikan parameter teknologi pemprosesan praktikal dan bukti mekanistik awal untuk membangunkanCistanche tubulosaproduk penjagaan kesihatan yang berkaitan.

5. Kesimpulan

Kesimpulannya, aliran kerja pemprosesan moden yang dioptimumkan oleh metodologi permukaan tindak balas Box‑Behnken (ketebalan kepingan 0.6 cm, mengukus 6 minit, suhu pengeringan 57 darjah) boleh meningkatkan kandungan acteoside dan echinacoside dengan ketara.Cistanche tubulosapotongan rebusan. Ekstrak yang disediakan daripada hirisan herba yang diproses secara optimum ini memberikan kesan anti-oksidatif-tekanan dan anti-radang yang ketara terhadap kerosakan makrofaj RAW264.7 yang disebabkan oleh LPS. Mekanisme asas dikaitkan dengan pemulihan sistem pertahanan antioksidan intraselular dan perencatan pengaktifan berlebihan laluan isyarat radang p38/AKT/JNK/NF‑κB. Kajian ini menyediakan asas eksperimen yang kukuh untuk pengeluaran perindustrian piawai dan eksploitasi makanan berfungsiCistanche tubulosasumber.

Rujukan

Lin J, Yu H, Zhao Y, et al. Pengekstrakan echinacoside daripadaCistanche tubulosa(Schenk) R. Wight dan penyiasatan kesan perlindungannya terhadap kecederaan hati pada tikus sepsis. Food Sci Technol, 2023, 43:e010523.

Guo J, Tang S, Miao Y, et al. Kesan anti-radang glikosida lignan daripadaCistanche tubulosaberpunca pada sel makrofaj RAW264.7 yang disebabkan oleh LPS/IFN melalui laluan PI3K/AKT. Bioteknologi Farmaseutikal Semasa, 2021, 22(10):1380‑1391.

Rani V, Deep G, Singh RK, et al. Tekanan oksidatif dan gangguan metabolik: Patogenesis dan strategi terapeutik. Sains Hayat, 2016,148:183‑193.

Park JH, Kim JH, Jang SI. Anti-radang dise-necionyl cis-khellactone dalam sel RAW264.7 yang dirangsang LPS dan aktiviti perencatannya pada hidrolase epoksida larut. Heliyon, 2023,9(10):e21032.

Chung YC, Song S J. Isobavachin mengurangkan tindak balas keradangan yang disebabkan oleh lipopolysaccharide dalam makrofaj dengan menekan laluan isyarat MAPK dan NF‑κB. Jurnal Etnofarmakologi, 2024,321:117501.

He X, Li Y, Deng B. Laluan isyarat PI3K/AKT dalam keradangan, kematian sel dan pembentukan parut glial selepas kecederaan saraf tunjang traumatik. Pembiakan Sel, 2022,55(9):e13275.