1. Pengenalan

Mengenal pasti bahan makanan dengan sifat imunomodulator bersama dengan sasaran molekul masing-masing telah menarik minat yang meningkat dalam beberapa tahun kebelakangan ini. Oleh kerana kepelbagaian ligan yang tinggi, superfamili potensi reseptor sementara bagi saluran ion (saluran TRP) mewakili kelas struktur sasaran berpotensi yang sangat menarik.

Superfamili saluran TRP mamalia termasuk enam keluarga protein yang berkaitan, iaitu ankyrin (TRPA), kanonik (TRPC), melastatin (TRPM), mucolipin (TRPML), polycystin (TRPP), dan keluarga vanilloid (TRPV), yang kesemuanya biasanya berkongsi enam segmen transmembran yang terhimpun sebagai tetramer yang boleh berubah-ubah untuk membentuk resapan-kation. Saluran TRPV1 mungkin, setakat ini, ahli keluarga super TRP yang paling disiasat secara intensif. TRPV1 pada mulanya dikenal pasti sebagai reseptor untuk capsaicin, komponen pedas lada cili.[2] Kemudian, juga bahan pedas dari halia, halia, ditunjukkan untuk mengaktifkan TRPV1.[3]

Peranan biologi TRPV1 dalam jenis sel bukan neuron masih dalam penyiasatan yang meluas, namun keputusan yang tersedia membayangkan fungsi yang jauh melebihi persepsi deria dan haba. Sebagai contoh, campur tangan selama 12 minggu dengan dos harian 0.15 mg TRPV1 agonis nonivamide, analog capsaicin struktur, menghalang peningkatan akibat pemakanan dalam jisim lemak badan, dan meningkatkan tahap serotonin plasma dalam subjek berat badan berlebihan yang sihat.[4]

Dalam adiposit 3T3-L1 pengaktifan TRPV1 oleh nonivamide mengurangkan pengumpulan lipid semasa pembezaan dan kematangan dengan menekan ekspresi PPAR𝛾.[5] Dalam makrofaj, capsaicin dan nonivamide melemahkan pelepasan sitokin pro-radang yang disebabkan oleh LPS seperti IL6, CXCL8, dan TNF-alpha, dalam cara yang bergantung kepada TRPV1.[6] Namun, fungsi tertentu TRPV1 dalam leukosit darah manusia masih kabur. Dalam sel NK manusia, capsaicin 10 dan 50 μM mendorong peningkatan kepekatan Ca2+ intrasel, menunjukkan saluran TRPV1 yang berfungsi.[7]

Walau bagaimanapun, fungsi efektor sel NK yang dilembapkan seperti degranulasi sitotoksik dan rembesan sitokin, yang disebabkan oleh pra-rawatan sel dengan capsaicin selama 1 jam dalam julat kepekatan 10–100 μM, sebahagian besarnya bebas TRPV1.[7] Dalam sel T, TRPV1 telah didokumenkan terlibat dalam proses isyarat reseptor sel T, percambahan dan pembezaan sel T, serta pengeluaran sitokin.[8] Kerja sebelumnya dari kumpulan kami juga menunjukkan ekspresi fungsi TRPV1 dalam sel T primer manusia.[9] Tambahan pula, analisis tindak balas dos dalam kepekatan antara 0.03 hingga 300 μmol L−1 mendedahkan bahawa [6]-gingerol menghalang rembesan sitokin oleh leukosit manusia primer dengan nilai IC50 82.2 μmol L−1.

Walau bagaimanapun, kuantiti [6]-gingerol dalam sampel plasma subjek sihat menunjukkan purata kepekatan plasma maksimum hanya 42.0 ± 16.3 nmol L−1 selepas pengambilan 1 L teh halia. Oleh kerana kepekatan [6]- gingerol ini tidak mempunyai kesan yang ketara terhadap rembesan sitokin dalam kajian terdahulu, [9] adalah tidak jelas, sama ada kepekatan diet yang relevan 50 nmol L−1, dicapai dalam plasma darah selepas pengambilan 1 L teh halia, adalah mencukupi untuk memodulasi tindak balas imun selular dalam leukosit primer manusia yang lain.

Bagi neutrofil manusia, pengetahuan tentang peranan fungsi TRPV1 adalah terhad. Manakala Köse dan Nazıroglu˘ [10] menunjukkan Ca2+-fluks dalam neutrofil sebagai tindak balas kepada 10 μM capsaicin yang akan dikurangkan oleh TRPV1 antagonis capsazepine, keputusan lain tidak menunjukkan capsaicin untuk mendorong Ca2+ influks apabila diuji dalam julat kepekatan 1 μM10, TRPV1-10. ungkapan.[11]

Neutrofil adalah leukosit yang paling banyak dalam darah manusia, menyumbang 60-70% daripada semua sel darah putih yang beredar. Mereka adalah sel imun pertama yang direkrut ke tapak jangkitan; oleh itu mereka sering dirujuk sebagai barisan pertahanan pertama.[12] Pengambilan neutrofil dicetuskan oleh, antara lain, peptida yang berasal dari bakteria atau mitokondria N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLF) atau kemokin seperti CXCL8 (IL-8).[13]

Mekanisme pertahanan neutrofil termasuk fagositosis,[14] pembebasan enzim anti-mikrob melalui degranulasi,[15] penjanaan spesies oksigen reaktif (ROS),[16] dan pembentukan perangkap ekstraselular neutrofil.[17] Selain mekanisme pertahanan langsung ini, neutrofil seterusnya menyumbang kepada tindak balas imun seterusnya melalui pembebasan pelbagai sitokin dan kemokin.[18] Juga, neutrofil boleh menjalani proses penyebuan yang membolehkan mereka bertindak balas dengan lebih kuat kepada pengaktifan penuh berikutnya.[16b]

Dalam tahun-tahun kebelakangan ini, bukti telah berkembang bahawa ramuan daripada makanan dan atau tumbuhan ubatan boleh mengubah suai satu atau lebih daripada tindak balas pertahanan neutrofil manusia yang disebutkan. Pengubahsuaian ini termasuk peningkatan aktiviti fagositosis[19] dan penjanaan ROS,[20] menambah kemotaksis ke arah fMLF,[21] dan pembentukan perangkap ekstraselular neutrofil.[20] Walau bagaimanapun, sebatian aktif tidak dikenal pasti. Juzuk daripada Ferula akitschkensis (𝛽-pinene, sabinene, 𝛾-terpinene, geranylacetone, dan isobornylacetate) menyahpekakan neutrofil kepada fMLF- dan CXCL8- influks Ca2+ dan menghalang kesan fMLF yang disebabkan oleh kemotraksilacetin, di mana kemotraksis yang disebabkan oleh fMLF. TRPV1.[22]

Berdasarkan data yang ada, kami membuat hipotesis bahawa pengaktifan TRPV1 yang disebabkan oleh ligan oleh [6]-gingerol boleh menjejaskan fungsi neutrofil umum, sama ada secara langsung atau melalui meningkatkan tindak balas mereka untuk mengaktifkan rangsangan. Dalam skop hipotesis ini, kami bertujuan untuk menjelaskan, sama ada kepekatan berkaitan pemakanan yang disahkan mencukupi untuk memodulasi tindak balas imun selular dalam neutrofil primer manusia sebagai sebahagian daripada populasi leukosit. '

Tambahan pula, kami berusaha untuk membandingkan tahap ekspresi RNA semua ahli superfamili TRP mamalia dalam lima jenis sel yang paling menonjol dalam darah manusia untuk mendapatkan gambaran keseluruhan secara kualitatif dan kuantitatif mengenai ekspresi saluran TRP dalam leukosit manusia.

2. Keputusan

2.1. Kelimpahan dan Tahap Transkrip Relatif Saluran TRP dalam Leukosit Manusia

Untuk menilai ekspresi RNA saluran TRP dalam leukosit darah, lima daripada jenis sel leukosit yang paling menonjol telah diasingkan daripada darah penderma yang sihat dan ekspresi RNA saluran TRP dianalisis melalui RT-PCR kuantitatif (Rajah 1).

Transkrip khusus TRPV serta keluarga TRPM dikesan dengan frekuensi tinggi 75-100% dalam semua jenis sel yang dianalisis. Purata kekerapan keseluruhan mempertimbangkan semua jenis sel ialah 96% untuk keluarga TRPV dan 98% untuk keluarga TRPM. Transkrip khusus TRPC adalah kurang banyak, antara 0% dalam monosit, sel NK, sel T, dan sel B hingga 100% dalam sel NK, dan sel T dengan kekerapan purata keseluruhan hanya 53% (Rajah 1A). Transkrip khusus TRPC5 hanya dikesan dalam neutrofil, dengan kekerapan 70%.

Juga, transkrip khusus TRPA1 secara amnya mendedahkan kelimpahan yang agak rendah dalam jenis sel yang dianalisis dengan kekerapan 100% dalam neutrofil, 25% dalam monosit, 80% dalam sel NK, 100% dalam sel T, dan 60% dalam sel B. Begitu juga, transkrip khusus TRPML3 menunjukkan frekuensi rendah dalam neutrofil (50%), monosit (25%), sel NK (40%), dan sel B (20%), tetapi kekerapan 100% dalam sel T. Transkrip khusus TRPV1 dikesan dalam semua jenis sel, menunjukkan kekerapan 100% dalam monosit, sel NK, dan sel T, dan kekerapan 90% dalam neutrofil dan 80% dalam sel B.

Mengenai ekspresi RNA relatif, berbanding dengan frekuensi masing-masing, saluran TRP mendedahkan corak ekspresi jenis sel yang lebih spesifik, seperti yang terbukti dengan perbandingan nilai Δct masing-masing dalam jenis sel yang berbeza yang dianalisis (Rajah 1B). Sebagai contoh, TRPP3 dikesan dengan kekerapan 100% dalam semua jenis sel, tetapi dengan jelas mendedahkan tahap ekspresi tertinggi dalam monosit.

Sebaliknya, saluran TRPV2 dikesan dalam semua jenis sel yang disiasat, dengan tahap ekspresi RNA yang tinggi serta frekuensi tinggi. Begitu juga, tahap transkrip TRPV1 adalah serupa dalam semua jenis sel yang diperiksa (Rajah 1B).

2.2. Ungkapan Permukaan TRPV1 pada Neutrofil

Pengetahuan semasa tentang fungsi TRPV1 dalam neutrofil manusia masih tidak jelas. Untuk meneroka lebih lanjut peranan TRPV1 dalam neutrofil manusia, kami seterusnya menyiasat sama ada saluran TRPV1 dinyatakan pada permukaan neutrofil manusia primer menggunakan sitometri aliran sel hidup (Rajah 2).

Neutrofil terpencil telah diwarnakan untuk CD15 sebagai penanda permukaan untuk neutrofil (Rajah 2A, B) dan serentak sama ada diwarnai dengan antibodi yang dinaikkan terhadap epitope dalam gelung ekstraselular pertama protein TRPV1 (Rajah 2B) atau kawalan isotype masing-masing, yang terakhir berfungsi sebagai pengganti untuk mengukur un2A Figure. Dalam populasi CD15+, keamatan pendarfluor untuk FITC telah dianalisis. Pewarnaan neutrofil dengan antibodi TRPV1 membawa kepada isyarat pendarfluor yang boleh dibezakan dengan jelas berbanding kawalan isotype, dengan itu mengesahkan ekspresi permukaan TRPV1 dalam neutrofil manusia primer (Rajah 2C). Menganalisis neutrofil daripada empat penderma individu mendedahkan ekspresi permukaan TRPV1 yang setanding (Rajah 2D).

2.3. [6]-Peningkatan Terdorong Gingerol dalam Ca Intraselular2+

Oleh kerana pengaktifan TRPV1 yang disebabkan oleh ligan akan mengakibatkan kemasukan Ca2+, [23] kepekatan Ca2+ intraselular neutrofil ditentukan melalui pewarna sensitif Ca2+- Fura-2. Berdasarkan penemuan kami sebelum ini, [9] kepekatan 50 nM ligan TRPV1 yang terkenal [6]-gingerol dan masa inkubasi selama 2 jam telah dipilih. Analisis menunjukkan bahawa pengeraman neutrofil dengan 50 nM [6]-gingerol menghasilkan peningkatan kepekatan Ca2+ intraselular yang secara purata 18.4% ± 1.0% daripada nilai maksimum, seperti yang ditentukan dengan menggunakan 1 μM ionofor ionomisin. Peningkatan yang disebabkan oleh DMSO adalah pada 4.7% ± 1.2% (Rajah 3).

2.4. Kesan [6]-Gingerol pada Ungkapan TRPV1

Seterusnya, kami bertujuan untuk menganalisis kesan rangsangan TRPV1 oleh [6]-gingerol pada ekspresi TRPV1 pada tahap transkrip melalui q-RTPCR serta pada tahap protein permukaan melalui pewarnaan sel hidup. Untuk tujuan ini, neutrofil manusia diinkubasi dengan 50 nM [6]- gingerol selama 2 jam dan tahap ekspresi masing-masing dikira.

Inkubasi 2 jam ini tidak memberi kesan kepada transkrip TRPV1 mahupun paras protein (Rajah 4), dan juga tidak berubah, kecuali IL6, IL17A, IL24, C5, dan GDF5, ekspresi RNA gen sitokin dan chemokine biasa yang disiasat (Rajah S1, Jadual S2, Maklumat Sokongan).

2.5. Kesan [6]-Gingerol pada Ekspresi Penanda Permukaan Neutrofil

1. Pengenalan

Mengenal pasti bahan makanan dengan sifat imunomodulator bersama dengan sasaran molekul masing-masing telah menarik minat yang meningkat dalam beberapa tahun kebelakangan ini. Oleh kerana kepelbagaian ligan yang tinggi, superfamili potensi reseptor sementara bagi saluran ion (saluran TRP) mewakili kelas struktur sasaran berpotensi yang sangat menarik.

Superfamili saluran TRP mamalia termasuk enam keluarga protein yang berkaitan, iaitu ankyrin (TRPA), kanonik (TRPC), melastatin (TRPM), mucolipin (TRPML), polycystin (TRPP), dan keluarga vanilloid (TRPV), yang kesemuanya biasanya berkongsi enam segmen transmembran yang terhimpun sebagai tetramer yang boleh berubah-ubah untuk membentuk resapan-kation. Saluran TRPV1 mungkin, setakat ini, ahli keluarga super TRP yang paling disiasat secara intensif. TRPV1 pada mulanya dikenal pasti sebagai reseptor untuk capsaicin, komponen pedas lada cili.[2] Kemudian, juga bahan pedas dari halia, halia, ditunjukkan untuk mengaktifkan TRPV1.[3]

Peranan biologi TRPV1 dalam jenis sel bukan neuron masih dalam penyiasatan yang meluas, namun keputusan yang tersedia membayangkan fungsi yang jauh melebihi persepsi deria dan haba. Sebagai contoh, campur tangan selama 12 minggu dengan dos harian 0.15 mg TRPV1 agonis nonivamide, analog capsaicin struktur, menghalang peningkatan akibat pemakanan dalam jisim lemak badan, dan meningkatkan tahap serotonin plasma dalam subjek berat badan berlebihan yang sihat.[4]

Dalam adiposit 3T3-L1 pengaktifan TRPV1 oleh nonivamide mengurangkan pengumpulan lipid semasa pembezaan dan kematangan dengan menekan ekspresi PPAR𝛾.[5] Dalam makrofaj, capsaicin dan nonivamide melemahkan pelepasan sitokin pro-radang yang disebabkan oleh LPS seperti IL6, CXCL8, dan TNF-alpha, dalam cara yang bergantung kepada TRPV1.[6] Namun, fungsi tertentu TRPV1 dalam leukosit darah manusia masih kabur. Dalam sel NK manusia, capsaicin 10 dan 50 μM mendorong peningkatan kepekatan Ca2+ intrasel, menunjukkan saluran TRPV1 yang berfungsi.[7]

Walau bagaimanapun, fungsi efektor sel NK yang dilembapkan seperti degranulasi sitotoksik dan rembesan sitokin, yang disebabkan oleh pra-rawatan sel dengan capsaicin selama 1 jam dalam julat kepekatan 10–100 μM, sebahagian besarnya bebas TRPV1.[7] Dalam sel T, TRPV1 telah didokumenkan terlibat dalam proses isyarat reseptor sel T, percambahan dan pembezaan sel T, serta pengeluaran sitokin.[8] Kerja sebelumnya dari kumpulan kami juga menunjukkan ekspresi fungsi TRPV1 dalam sel T primer manusia.[9] Tambahan pula, analisis tindak balas dos dalam kepekatan antara 0.03 hingga 300 μmol L−1 mendedahkan bahawa [6]-gingerol menghalang rembesan sitokin oleh leukosit manusia primer dengan nilai IC50 82.2 μmol L−1.

Walau bagaimanapun, kuantiti [6]-gingerol dalam sampel plasma subjek sihat menunjukkan purata kepekatan plasma maksimum hanya 42.0 ± 16.3 nmol L−1 selepas pengambilan 1 L teh halia. Oleh kerana kepekatan [6]- gingerol ini tidak mempunyai kesan yang ketara terhadap rembesan sitokin dalam kajian terdahulu, [9] adalah tidak jelas, sama ada kepekatan diet yang relevan 50 nmol L−1, dicapai dalam plasma darah selepas pengambilan 1 L teh halia, adalah mencukupi untuk memodulasi tindak balas imun selular dalam leukosit primer manusia yang lain.

Bagi neutrofil manusia, pengetahuan tentang peranan fungsi TRPV1 adalah terhad. Manakala Köse dan Nazıroglu˘ [10] menunjukkan Ca2+-fluks dalam neutrofil sebagai tindak balas kepada 10 μM capsaicin yang akan dikurangkan oleh TRPV1 antagonis capsazepine, keputusan lain tidak menunjukkan capsaicin untuk mendorong Ca2+ influks apabila diuji dalam julat kepekatan 1 μM10, TRPV1-10. ungkapan.[11]

Neutrofil adalah leukosit yang paling banyak dalam darah manusia, menyumbang 60-70% daripada semua sel darah putih yang beredar. Mereka adalah sel imun pertama yang direkrut ke tapak jangkitan; oleh itu mereka sering dirujuk sebagai barisan pertahanan pertama.[12] Pengambilan neutrofil dicetuskan oleh, antara lain, peptida yang berasal dari bakteria atau mitokondria N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLF) atau kemokin seperti CXCL8 (IL-8).[13]

Mekanisme pertahanan neutrofil termasuk fagositosis,[14] pembebasan enzim anti-mikrob melalui degranulasi,[15] penjanaan spesies oksigen reaktif (ROS),[16] dan pembentukan perangkap ekstraselular neutrofil.[17] Selain mekanisme pertahanan langsung ini, neutrofil seterusnya menyumbang kepada tindak balas imun seterusnya melalui pembebasan pelbagai sitokin dan kemokin.[18] Juga, neutrofil boleh menjalani proses penyebuan yang membolehkan mereka bertindak balas dengan lebih kuat kepada pengaktifan penuh berikutnya.[16b]

Dalam tahun-tahun kebelakangan ini, bukti telah berkembang bahawa ramuan daripada makanan dan atau tumbuhan ubatan boleh mengubah suai satu atau lebih daripada tindak balas pertahanan neutrofil manusia yang disebutkan. Pengubahsuaian ini termasuk peningkatan aktiviti fagositosis[19] dan penjanaan ROS,[20] menambah kemotaksis ke arah fMLF,[21] dan pembentukan perangkap ekstraselular neutrofil.[20] Walau bagaimanapun, sebatian aktif tidak dikenal pasti. Juzuk daripada Ferula akitschkensis (𝛽-pinene, sabinene, 𝛾-terpinene, geranylacetone, dan isobornylacetate) menyahpekakan neutrofil kepada fMLF- dan CXCL8- influks Ca2+ dan menghalang kesan fMLF yang disebabkan oleh kemotraksilacetin, di mana kemotraksis yang disebabkan oleh fMLF. TRPV1.[22]

Berdasarkan data yang ada, kami membuat hipotesis bahawa pengaktifan TRPV1 yang disebabkan oleh ligan oleh [6]-gingerol boleh menjejaskan fungsi neutrofil umum, sama ada secara langsung atau melalui meningkatkan tindak balas mereka untuk mengaktifkan rangsangan. Dalam skop hipotesis ini, kami bertujuan untuk menjelaskan, sama ada kepekatan berkaitan pemakanan yang disahkan mencukupi untuk memodulasi tindak balas imun selular dalam neutrofil primer manusia sebagai sebahagian daripada populasi leukosit. '

Tambahan pula, kami berusaha untuk membandingkan tahap ekspresi RNA semua ahli superfamili TRP mamalia dalam lima jenis sel yang paling menonjol dalam darah manusia untuk mendapatkan gambaran keseluruhan secara kualitatif dan kuantitatif mengenai ekspresi saluran TRP dalam leukosit manusia.

2. Keputusan

2.1. Kelimpahan dan Tahap Transkrip Relatif Saluran TRP dalam Leukosit Manusia

Untuk menilai ekspresi RNA saluran TRP dalam leukosit darah, lima daripada jenis sel leukosit yang paling menonjol telah diasingkan daripada darah penderma yang sihat dan ekspresi RNA saluran TRP dianalisis melalui RT-PCR kuantitatif (Rajah 1).

Transkrip khusus TRPV serta keluarga TRPM dikesan dengan frekuensi tinggi 75-100% dalam semua jenis sel yang dianalisis. Purata kekerapan keseluruhan mempertimbangkan semua jenis sel ialah 96% untuk keluarga TRPV dan 98% untuk keluarga TRPM. Transkrip khusus TRPC adalah kurang banyak, antara 0% dalam monosit, sel NK, sel T, dan sel B hingga 100% dalam sel NK, dan sel T dengan kekerapan purata keseluruhan hanya 53% (Rajah 1A). Transkrip khusus TRPC5 hanya dikesan dalam neutrofil, dengan kekerapan 70%.

Juga, transkrip khusus TRPA1 secara amnya mendedahkan kelimpahan yang agak rendah dalam jenis sel yang dianalisis dengan kekerapan 100% dalam neutrofil, 25% dalam monosit, 80% dalam sel NK, 100% dalam sel T, dan 60% dalam sel B. Begitu juga, transkrip khusus TRPML3 menunjukkan frekuensi rendah dalam neutrofil (50%), monosit (25%), sel NK (40%), dan sel B (20%), tetapi kekerapan 100% dalam sel T. Transkrip khusus TRPV1 dikesan dalam semua jenis sel, menunjukkan kekerapan 100% dalam monosit, sel NK, dan sel T, dan kekerapan 90% dalam neutrofil dan 80% dalam sel B.

Mengenai ekspresi RNA relatif, berbanding dengan frekuensi masing-masing, saluran TRP mendedahkan corak ekspresi jenis sel yang lebih spesifik, seperti yang terbukti dengan perbandingan nilai Δct masing-masing dalam jenis sel yang berbeza yang dianalisis (Rajah 1B). Sebagai contoh, TRPP3 dikesan dengan kekerapan 100% dalam semua jenis sel, tetapi dengan jelas mendedahkan tahap ekspresi tertinggi dalam monosit.

Sebaliknya, saluran TRPV2 dikesan dalam semua jenis sel yang disiasat, dengan tahap ekspresi RNA yang tinggi serta frekuensi tinggi. Begitu juga, tahap transkrip TRPV1 adalah serupa dalam semua jenis sel yang diperiksa (Rajah 1B).

2.2. Ungkapan Permukaan TRPV1 pada Neutrofil

Pengetahuan semasa tentang fungsi TRPV1 dalam neutrofil manusia masih tidak jelas. Untuk meneroka lebih lanjut peranan TRPV1 dalam neutrofil manusia, kami seterusnya menyiasat sama ada saluran TRPV1 dinyatakan pada permukaan neutrofil manusia primer menggunakan sitometri aliran sel hidup (Rajah 2).

Neutrofil terpencil telah diwarnakan untuk CD15 sebagai penanda permukaan untuk neutrofil (Rajah 2A, B) dan serentak sama ada diwarnai dengan antibodi yang dinaikkan terhadap epitope dalam gelung ekstraselular pertama protein TRPV1 (Rajah 2B) atau kawalan isotype masing-masing, yang terakhir berfungsi sebagai pengganti untuk mengukur un2A Figure. Dalam populasi CD15+, keamatan pendarfluor untuk FITC telah dianalisis. Pewarnaan neutrofil dengan antibodi TRPV1 membawa kepada isyarat pendarfluor yang boleh dibezakan dengan jelas berbanding kawalan isotype, dengan itu mengesahkan ekspresi permukaan TRPV1 dalam neutrofil manusia primer (Rajah 2C). Menganalisis neutrofil daripada empat penderma individu mendedahkan ekspresi permukaan TRPV1 yang setanding (Rajah 2D).

2.3. [6]-Peningkatan Terdorong Gingerol dalam Ca Intraselular2+

Oleh kerana pengaktifan TRPV1 yang disebabkan oleh ligan akan mengakibatkan kemasukan Ca2+, [23] kepekatan Ca2+ intraselular neutrofil ditentukan melalui pewarna sensitif Ca2+- Fura-2. Berdasarkan penemuan kami sebelum ini, [9] kepekatan 50 nM ligan TRPV1 yang terkenal [6]-gingerol dan masa inkubasi selama 2 jam telah dipilih. Analisis menunjukkan bahawa pengeraman neutrofil dengan 50 nM [6]-gingerol menghasilkan peningkatan kepekatan Ca2+ intraselular yang secara purata 18.4% ± 1.0% daripada nilai maksimum, seperti yang ditentukan dengan menggunakan 1 μM ionofor ionomisin. Peningkatan yang disebabkan oleh DMSO adalah pada 4.7% ± 1.2% (Rajah 3).

2.4. Kesan [6]-Gingerol pada Ungkapan TRPV1

Seterusnya, kami bertujuan untuk menganalisis kesan rangsangan TRPV1 oleh [6]-gingerol pada ekspresi TRPV1 pada tahap transkrip melalui q-RTPCR serta pada tahap protein permukaan melalui pewarnaan sel hidup. Untuk tujuan ini, neutrofil manusia diinkubasi dengan 50 nM [6]- gingerol selama 2 jam dan tahap ekspresi masing-masing dikira.

Inkubasi 2 jam ini tidak memberi kesan kepada transkrip TRPV1 mahupun paras protein (Rajah 4), dan juga tidak berubah, kecuali IL6, IL17A, IL24, C5, dan GDF5, ekspresi RNA gen sitokin dan chemokine biasa yang disiasat (Rajah S1, Jadual S2, Maklumat Sokongan).

2.5. Kesan [6]-Gingerol pada Ekspresi Penanda Permukaan Neutrofil

Potong Pil Jinkui Shenqi menjadi kepingan, timbang dengan tepat kira-kira 2.0 g sampel dan pindahkan ke dalam kelalang kon bersumbat. Tambah 25 mL metanol 70%, timbang jumlah jisim, dan lakukan pengekstrakan ultrasonik (300 W, 40 kHz) selama 35 minit. Selepas menyejukkan ke suhu bilik, isikan semula berat yang hilang dengan 70% metanol dan goncang dengan baik. Tapis larutan melalui membran mikroporous 0.45 μm untuk mendapatkan larutan ujian.

 

Pengimbasan panjang gelombang penuh (190-400 nm) telah dijalankan untuk memilih panjang gelombang pengesanan. Walaupun morroniside dan loganin mempunyai penyerapan maksimum pada 230-240 nm, panjang gelombang ini mengalami bunyi asas yang tinggi. Panjang gelombang 254 nm memastikan tindak balas yang stabil dan gangguan latar belakang yang rendah. Paeonol, asid sinamat, acteoside dan 7-hydroxycoumarin semuanya menghasilkan penyerapan ultraviolet yang stabil pada 254 nm. Oleh itu, 254 nm dipilih sebagai panjang gelombang pengesanan bersatu untuk analisis segerak berbilang komponen.

 

Di antara semua bahan mentah herba semulajadi,Cistanche tubulosa (Desertliving Cistanche)menonjol sebagai herba dengankandungan acteoside tertinggisecara global. Sebagai inti glikosida phenylethanoid, acteoside terkenal dengan anti-radang, antioksidan, pelindung saraf dan pengawalan imun. Kilang kami mengkhususkan diri dalam ekstrak Cistanche tubulosa ketulenan tinggi, yang mengandungi tahap acteoside dan bahan aktif lain yang jauh lebih tinggi daripada bahan herba biasa, menjadikannya bahan mentah yang ideal untuk membangunkan suplemen diet premium, makanan berfungsi, minuman herba dan produk penjagaan kulit untuk pasaran Eropah dan Amerika.

 

 

Acteoside, komponen tandatangan ekstrak Cistanche tubulosa kami, memberikan pelbagai manfaat teras yang sepadan dengan permintaan kesihatan pengguna Eropah dan Amerika: anti-radang, peningkatan imun, anti-hipoksia, penghapusan radikal bebas, pembaikan DNA dan perlindungan hati. Digabungkan dengan echinacoside (antioksidan, perlindungan saraf, perlindungan kardiovaskular) dan polisakarida (regulasi imun), ekstrak kami menyepadukan semua keberkesanan arus perdana ramuan herba premium yang dinyatakan di atas, termasukanti-radang, antibakteria, antioksidan, pengawalan imun dan perlindungan kardiovaskular.